葡甘露低聚糖的酶法制備及其對腸道微生物的增殖作用

王蓉，王靜，賴晨歡，黃曹興，凌喆，勇強*

(1. 南京林業大學，江蘇省林業資源高效加工利用協同創新中心，南京 210037；2. 廣東省林業科學研究院，廣東省森林培育與保護利用重點實驗室，廣州 510520)

葡甘露低聚糖(Glucomannan oligosaccharides，GMOS)是由2～20個葡萄糖或甘露糖通過糖苷鍵連接而成的低聚合度糖類的總稱，具有防癌抗癌[1]、免疫調節和細胞修復等生物學功能[2]，是一種重要的功能性低聚糖。葡甘露低聚糖可通過選擇性降解葡甘露聚糖制得，目前已報道的葡甘露低聚糖制備方法主要有物理降解、氧化降解、酸水解和酶水解等[3-4]，其中酶水解法具有專一性強、反應條件溫和及綠色環保等優點，工業應用前景廣闊。

β-甘露聚糖酶(EC 3.2.1.78)是一類可以水解β-D-1,4-甘露糖苷鍵的內切型水解酶，其能夠隨機水解葡甘露聚糖主鏈中的β-D-1,4-糖苷鍵生成葡甘露低聚糖。里氏木霉(Trichodermareesei)是常用的β-甘露聚糖酶生產菌株之一，其所產的酶具有穩定性好且對人和動物安全的特點，被廣泛應用于食品和飼料工業生產中。里氏木霉源甘露聚糖水解酶系中除了β-甘露聚糖酶，還含有β-甘露糖苷酶(EC 3.2.1.25)和β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21)等糖苷水解酶。其中，β-甘露糖苷酶可作用于葡甘露低聚糖的末端，催化β-1,4-糖苷鍵水解釋放出甘露糖[5]。因此，研究甘露聚糖酶酶系組成對葡甘露低聚糖的酶法制備具有重要意義。

筆者以里氏木霉為產酶菌株，研究碳源誘導物對甘露聚糖酶酶系組成的影響以及魔芋葡甘露聚糖酶法制備葡甘露低聚糖工藝，并在體外模擬人體腸道嚴格厭氧環境，研究葡甘露低聚糖對腸道微生物的增殖作用，研究結果可為葡甘露聚糖選擇性降解制備葡甘露低聚糖技術的建立以及葡甘露低聚糖的應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

里氏木霉(T.reesei)Rut C-30，由南京林業大學生物化工研究所提供；腸道微生物典型菌株雙歧桿菌乳酸亞種BifidobateriumanimalissubspecieslactisB-41405，動物雙歧桿菌亞種B.animalissubspeciesanimalisB-41406，雙歧桿菌B.suisB-41407，短雙歧桿菌B.breveB-41408，兩歧雙歧桿菌B.bifidumB-41410，嬰兒雙歧桿菌B.infantisB-41661，嗜酸乳桿菌LactobacillusacidophilusB-4495，清酒乳酸菌L.sakeiB-1917，羅伊式乳桿菌L.reuteriB-14172，鼠李糖乳桿菌L.rhamnosusB-1937，丙酮丁醇梭菌ClostridiumacetobutylicumB-527，丙酮丁醇梭菌C.acetobutylicumB-528，丙酮丁醇梭菌C.acetobutylicumB-530，平腸球菌EnterococcushiraeB-1295，空腸彎曲菌CampylobacterjejuniS107，長雙歧桿菌B.longumATCC15697和大腸桿菌EscherichiacoliK12購自美國農業部菌種保藏中心(NRRL)和美國菌種保藏中心(ATCC)。

魔芋精粉，市售，購自云南省昆明市，魔芋精粉經乙醇沉淀法得到高純度葡甘露聚糖[6]，主要組成(質量分數，下同)：葡甘露聚糖81.3%，淀粉11.8%；微晶纖維素(92%)、洋槐豆膠(半乳甘露聚糖56%)、瓜爾豆膠(半乳甘露聚糖72%)、葡萄糖、甘露糖和木糖(分析純)均購自美國Sigma-Aldrich公司；其他試劑無特殊注明外，均為分析純。

1.2 培養基

β-甘露聚糖酶發酵培養基：碳源誘導物10.000 0 g/L、葡萄糖1.000 0 g/L、磷酸二氫鉀2.000 0 g/L、七水硫酸鎂0.300 0 g/L、無水氯化鈣0.300 0 g/L、七水硫酸亞鐵0.005 0 g/L、七水硫酸錳0.001 6 g/L、七水硫酸鋅0.001 4 g/L、氯化鈷0.002 0 g/L、硫酸銨4.720 0 g/L、尿素2.150 0 g/L，用1 mol/L檸檬酸緩沖溶液調節pH至4.8。

腸道微生物活化培養基：酪蛋白胨10.00 g/L、牛肉膏10.00 g/L、酵母提取物5.00 g/L、吐溫80 1.00 g/L、乙酸鈉5.00 g/L、檸檬酸二銨2.00 g/L、磷酸氫二鉀2.00 g/L、一水硫酸鎂0.20 g/L、一水硫酸錳0.05 g/L、葡萄糖10.00 g/L、L-半胱氨酸1.00 g/L，用質量分數4%NaOH調節pH至7.0。

腸道微生物增殖培養基：用3.00 g/L葡甘露低聚糖代替活化培養基中10.00 g/L的葡萄糖，其他成分不變。

1.3 試驗方法

1.3.1β-甘露聚糖酶發酵

在裝有50 mLβ-甘露聚糖酶發酵培養基中分別加入1 g絕干誘導物(微晶纖維素、洋槐豆膠、瓜爾豆膠、魔芋粉以及6種等質量的復配誘導物)，置于170 r/min搖床中培養4 d，產酶第1天溫度30 ℃，第2天后溫度為28 ℃。

1.3.2 腸道微生物體外培養

腸道微生物活化：活化培養基于121 ℃下滅菌15 min后，轉移到DUAL GAS YQX-1型厭氧培養箱(英國Ruskin Life Sciences公司)中，調節pH至7.0，接入17種腸道微生物凍干粉，于37 ℃下活化36 h。

腸道微生物培養：增殖培養基于121 ℃下滅菌15 min后，轉移到厭氧培養箱中，調節pH 7.0，吸取4.5 mL培養基于5.0 mL具塞螺紋試管中，接入0.5 mL腸道菌群活化液，于37 ℃下培養48 h。試驗按雙平行設計，數據用平均值和平均數標準誤差(standard error of the mean，SEM)表示。

1.3.3 葡甘露聚糖酶解

稱取適量葡甘露聚糖于100 mL酶解瓶中，加入蒸餾水、甘露聚糖酶液，并用質量分數8%H2SO4調節pH至4.8，定容至50 mL后置于50 ℃、150 r/min搖床中酶解。分別研究酶用量(5，10，15，20，25，30和35 U/g葡甘露聚糖)、底物質量濃度(5，10，15，20和25 g/L)和酶解時間(4，8，12，24，36和48 h)對葡甘露低聚糖得率的影響。

1.4 分析方法

1.4.1β-甘露聚糖酶活力測定

在試管中加入0.1 mL適當稀釋的酶液和0.9 mL用pH 5.0檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液配制的質量濃度為5.0 g/L的洋槐豆膠溶液，于50 ℃、80 r/min恒溫水浴中反應30 min，3,5-二硝基水楊酸(DNS)法測定水解產生的還原糖[7]。以每分鐘水解底物產生1 μmol還原糖(以甘露糖計)的酶用量定義為1個β-甘露聚糖酶活力單位(U)。

1.4.2β-甘露糖苷酶活力測定

在試管中加入0.1 mL適當稀釋的酶液和0.9 mL對硝基苯基-β-D-吡喃甘露糖苷(2 mmol/L)溶液，于50 ℃下保溫10 min后，立即加入2.0 mL的Na2CO3(1 mol/L)終止反應，于400 nm下測定吸光度[8]。以每分鐘水解對硝基苯基-β-D-吡喃甘露糖苷釋放1 μmol對硝基苯酚所需的酶量定義為1個β-甘露糖苷酶活力單位(U)。

1.4.3 濾紙酶活力測定

采用國際理論和應用化學協會(IUPAC)推薦的標準方法測定[9]。在標準反應條件下每分鐘水解生成1 μmol葡萄糖的酶用量定義為1個濾紙酶活力單位(FPU)。

1.4.4 木聚糖酶酶活力測定

在試管中加入0.5 mL適當稀釋的酶液和1 mL用0.05 mol/L檸檬酸緩沖液配制的質量分數1%的樺木木聚糖溶液，于50 ℃、80 r/min恒溫水浴中反應30 min，DNS法測定水解產生的木糖。以每分鐘水解生成1 μmol木糖所需的酶用量定義為1個木聚糖酶活力單位(U)。

1.4.5 葡萄糖和甘露糖定量分析

葡萄糖和甘露糖采用DINOX ICS-5000型高效液相陰離子交換色譜分析，外標法測定。色譜條件：Carbo Pac PA10色譜柱(孔徑×長=4 mm×250 mm)，進樣量10 μL，流動相3 mmol/L NaOH，流速0.2 mL/min，柱溫30 ℃，脈沖安培檢測器檢測。

1.4.6 葡甘露低聚糖的定量分析

在葡甘露聚糖酶解液中加入異丙醇至體積分數為90%，充分混勻后于8 000 r/min下離心5 min，葡甘露低聚糖溶解在上清中，蒸發除去上清中的異丙醇，冷凍干燥后收集固形物。固形物加水定容到一定體積V0，等體積加入質量分數8%的H2SO4，于121 ℃下反應1 h，采用高效陰離子交換色譜測定酸解前后葡萄糖和甘露糖的含量。葡甘露低聚糖得率和酶的選擇性計算如下式：

葡甘露低聚糖得率%=[(CA1+CA2-C1-C2) ×2V0×0.9/(m×0.813)]×100

(1)

酶的選擇性%=[(CA1+CA2-C1-C2)/(CA1+CA2)]×100

(2)

式中：CA1為酸解液中甘露糖質量濃度，g/L；CA2為酸解液中葡萄糖質量濃度，g/L；C1為酸解前甘露糖質量濃度，g/L；C2為酸解前葡萄糖質量濃度，g/L；0.9為聚糖和單糖的轉化系數；m為稱取的葡甘露聚糖的質量；0.813為稱取的原料中葡甘露聚糖的含量。

1.4.7 腸道微生物濃度測定

取1 mL腸道微生物培養液于10 000 r/min下離心5 min，得到菌體沉淀，用生理鹽水洗滌、離心3次，最后加入1 mL生理鹽水重懸，采用蒸餾水為空白對照，于600 nm波長下測定菌體的吸光度，根據菌體濃度與吸光度的標準曲線計算培養液中的菌體濃度。

1.4.8 短鏈脂肪酸定量分析

取培養液離心得到的上清，經0.22 μm濾膜過濾，采用高效液相色譜測定短鏈脂肪酸(乙酸、丙酸、丁酸和乳酸)含量，色譜條件：Bio-Rad Aminex HPX-87H色譜柱(長×孔徑=300 mm×7.8 mm)，進樣量10 μL，流動相5 mmol/L H2SO4，流速0.6 mL/min，柱溫55 ℃，示差折光檢測器檢測。

2 結果與分析

2.1 誘導物對里氏木霉發酵甘露聚糖酶酶系組成的影響

里氏木霉β-甘露聚糖酶屬于誘導型酶類，其最佳誘導物通常是作用底物或底物的結構類似物[10]。選取10種不同產酶誘導物，不同誘導物對里氏木霉合成甘露聚糖酶酶系組成的影響見表1，當添加富含甘露聚糖的洋槐豆膠、瓜爾豆膠和魔芋粉為產酶誘導物時，β-甘露聚糖酶酶活力分別為1.443,1.195和1.702 U/mL，而采用微晶纖維素作為里氏木霉的產酶誘導物時，β-甘露聚糖酶酶活力達到最高(3.902 U/mL)。王靜等[11]同樣發現，里氏木霉合成β-甘露聚糖酶的最佳碳源誘導物是與底物結構類似的微晶纖維素。

表1 不同產酶誘導物對甘露聚糖酶酶系組成的影響Table 1 Effects of different enzyme inducers on the composition of mannanase enzymes

發酵液中溶解氧水平是影響里氏木霉發酵產β-甘露聚糖酶的重要因素[12]，β-甘露聚糖溶于水后黏度增加，影響了里氏木霉好氧發酵產酶過程中的氧傳質，從而導致洋槐豆膠等誘導產酶作用較差。當微晶纖維素與其他甘露聚糖誘導物按質量比1∶1復配作為誘導物時，β-甘露聚糖酶酶活力為3.514～3.727 U/mL，均顯著高于單一甘露聚糖和復配碳源誘導產生的β-甘露聚糖酶酶活力(1.283～1.795 U/mL)，進一步驗證了微晶纖維素是里氏木霉合成β-甘露聚糖酶的最佳誘導物。其原因可能是編碼β-甘露聚糖酶、纖維素酶和木聚糖酶的基因在相同的啟動子操縱下表達，而里氏木霉合成β-甘露聚糖酶與其他糖苷水解酶時存在協同效應所致。

為驗證里氏木霉產β-甘露聚糖酶與纖維素酶和木聚糖酶的相關性，以微晶纖維素為碳源誘導物誘導6株里氏木霉菌株，分析其產酶粗酶液中β-甘露聚糖酶、纖維素酶和木聚糖酶酶活力，結果如圖1所示。由圖1a可知，當以微晶纖維素為誘導物時，6株里氏木霉菌株產酶的粗酶液中β-甘露聚糖酶活力與纖維素酶活力存在正相關性(決定系數R2=0.85)，說明微晶纖維素可同時誘導里氏木霉合成纖維素酶和β-甘露聚糖酶。由圖1b可知，粗酶液中β-甘露聚糖酶活力與木聚糖酶活力同樣存在正相關性(R2=0.72)，進一步驗證了微晶纖維素可同時誘導里氏木霉合成纖維素酶、β-甘露聚糖酶和木聚糖酶。原因可能是在里氏木霉基因組中，編碼半纖維素酶(β-甘露聚糖酶和木聚糖酶)和纖維素酶的基因是非隨機分布在基因組內，70%的半纖維素酶和纖維素酶的基因位于編碼糖苷水解酶(GH)的簇中[13]。

圖1 β-甘露聚糖酶與濾紙酶和木聚糖酶酶活力的相關性Fig. 1 Correlations between β-mannanase and filter paper enzyme and xylanase activities

β-甘露聚糖酶酶活與β-甘露糖苷酶酶活之比是評價甘露聚糖水解酶系組成是否適合于葡甘露低聚糖制備的重要指標之一，β-甘露聚糖酶與β-甘露糖苷酶活力比值越高，越適合于葡甘露低聚糖的酶法制備。由表1可知，以洋槐豆膠為單一和復配碳源誘導產甘露聚糖酶時，β-甘露聚糖酶活力與β-甘露糖苷酶活力之比較低，因此不適合應用于葡甘露低聚糖的制備；以瓜爾豆膠和魔芋粉為誘導物時，β-甘露聚糖酶活力與β-甘露糖苷酶活力之比分別為239.0和243.1，均高于微晶纖維素(205.4)，但微晶纖維素誘導產生的β-甘露聚糖酶活力遠高于瓜爾豆膠和魔芋粉誘導產生的β-甘露聚糖酶活力。綜合考慮選用微晶纖維素誘導里氏木霉合成的甘露聚糖酶進行后續的葡甘露低聚糖的制備。

2.2 酶法制備葡甘露低聚糖的影響因素

酶用量對葡甘露低聚糖得率的影響如圖2a所示。當酶用量從5 U/g葡甘露聚糖增加到10 U/g時，葡甘露低聚糖的得率從68.60%提高至76.80%，進一步提高酶用量至35 U/g時，葡甘露低聚糖得率下降至52.30%。酶解液中單糖含量隨著酶用量的增加而提高，當酶用量從5 U/g葡甘露聚糖增加到35 U/g時，酶解液中單糖含量從0.64 g/L提高到2.10 g/L；而酶對葡甘露低聚糖的選擇性則隨著酶用量的增加而降低(從84.90%下降至56.90%)。葡甘露低聚糖得率隨著酶用量的增加而降低的原因可能包括兩方面：一是隨著酶用量的增加，酶解體系中β-甘露糖苷酶和β-葡萄糖苷酶含量增加，促進了葡甘露低聚糖進一步水解成單糖(葡萄糖和甘露糖)；二是水解產物葡甘露低聚糖和單糖的積累可能對β-甘露聚糖酶存在反饋抑制作用[14]。因此，β-甘露聚糖酶酶法制備葡甘露低聚糖的適宜酶用量為10 U/g葡甘露聚糖。

圖2 工藝參數對葡甘露低聚糖制備的影響Fig. 2 Effects of process parameters on the GMOS preparation

底物質量濃度對葡甘露低聚糖得率的影響如圖2b所示。當底物質量濃度從5 g/L提高至15 g/L時，葡甘露低聚糖的得率從54.01%提高至74.10%；繼續增加底物質量濃度至25 g/L時，葡甘露低聚糖的得率下降至62.30%，原因可能是隨著底物質量濃度的提高，酶解體系的黏度增加，影響酶解體系中的傳質效率[15]。酶對葡甘露低聚糖的選擇性隨著底物質量濃度的提高而增加，當底物質量濃度從5 g/L提高至25 g/L時，酶對葡甘露低聚糖的選擇性從66.60%提高至83.40%。因此，β-甘露聚糖酶酶法制備葡甘露低聚糖的適宜底物質量濃度為15 g/L。

酶解時間對葡甘露低聚糖得率的影響如圖2c所示。在酶解初期，葡甘露低聚糖得率隨著反應時間的延長迅速提高，酶解8 h時，葡甘露低聚糖得率為73.70%；繼續延長酶反應時間，葡甘露低聚糖得率呈緩慢上升的趨勢；24 h后，葡甘露低聚糖得率呈下降趨勢。酶解體系中單糖含量與酶對葡甘露低聚糖的選擇性變化趨勢相反，隨著酶解反應時間延長，酶解液中單糖含量增加，而酶對葡甘露低聚糖的選擇性降低。因此，葡甘露聚糖酶法制備葡甘露低聚糖的適宜反應時間為8 h，在此條件下，葡甘露低聚糖得率和酶對葡甘露低聚糖的選擇性分別為73.70%和85.60%，顯著高于許少春等[16]利用黑曲霉酸性β-甘露聚糖酶酶解魔芋粉制備葡甘露低聚糖的得率(35.73%)，以及婁廣慶[17]對降解產物進行超濾得到葡甘露低聚糖得率(6.63%)。由此可知，酶法更適用于葡甘露低聚糖的制備，與黑曲霉相比，里氏木霉發酵生產的β-甘露聚糖酶更適用于葡甘露低聚糖的生產，其原因可能是β-甘露糖苷酶酶活更低，導致單糖產生更少。

2.3 葡甘露低聚糖作為碳源對腸道微生物的體外培養

2.3.1 葡甘露低聚糖對腸道微生物的增殖作用

3 g/L葡甘露低聚糖對典型腸道微生物(14種有益菌和3種潛在致病菌)體外嚴格厭氧培養，葡甘露低聚糖對腸道微生物的增殖作用如圖3所示。由圖3可知，葡甘露低聚糖對典型腸道微生物中14種有益菌均有增殖作用，而3種潛在致病菌平腸球菌(E.hiraeB-1295)、空腸彎曲菌(C.jejuniS107)和大腸桿菌(E.coliK12)幾乎不能利用葡甘露低聚糖進行增殖。其中，有益菌中長雙歧桿菌(B.longumATCC15697)和嗜酸乳桿菌(L.acidophilusB-4495)增殖效果最好，菌體質量濃度從初始的0.02 g/L分別提高到0.54 和0.39 g/L，分別增殖27.0和19.5倍；初始質量濃度為0.02 g/L的平腸球菌、空腸彎曲菌和大腸桿菌3種潛在致病菌以3 g/L 葡甘露低聚糖為碳源培養48 h，菌體質量濃度分別為0.07，0.03和0.02 g/L。

圖3 葡甘露低聚糖對腸道微生物的增殖作用Fig. 3 Effects of glucomannan oligosaccharides on the proliferation of intestinal microorganisms

2.3.2 腸道微生物代謝葡甘露低聚糖的短鏈脂肪酸產物分析

功能性低聚糖在人或動物體腸道中的作用除了促進腸道有益菌增殖，腸道微生物代謝功能性低聚糖產生的短鏈脂肪酸還具有降低腸道pH、抑制腸道腐敗細菌生長、防止便秘等功能，同時丁酸還具有營養腸道上皮細胞的作用。典型腸道微生物以3 g/L葡甘露低聚糖為碳源培養，不同腸道微生物代謝葡甘露低聚糖產生的短鏈脂肪酸情況如圖4所示。

圖4 腸道微生物發酵葡甘露低聚糖生成的短鏈脂肪酸分析Fig. 4 Short chain fatty acids production fermented by intestinal microorganisms with GMOS as a carbon source

與葡甘露低聚糖對腸道典型微生物增殖作用趨勢一致，長雙歧桿菌(B.longumATCC15697)和嗜酸乳桿菌(L.acidophilusB-4495)發酵葡甘露低聚糖產生的短鏈脂肪酸含量最高，分別為(78.5±3.5)和(42.6±2.6) mmol/L。其中，乳酸和丁酸是B.longumATCC15697和L.acidophilusB-4495發酵生成的主要短鏈脂肪酸，分別為(38.9±1.2),(32.1±7.1) mmol/L和(25.0±3.0),(14.0±4.0) mmol/L；而乙酸和丙酸含量低，僅為(4.5±0.4),(1.6±0.3) mmol/L和(0.3±0.1),(0.8±0.2) mmol/L；其他有益菌產生的短鏈脂肪酸的濃度相對較低，在3.0～32.0 mmol/L之間；而潛在致病菌中除空腸彎曲菌(C.jejuniS107)發酵產生9.9 mmol/L短鏈脂肪酸外，平腸球菌(E.hiraeB-1295)和大腸桿菌(E.coliK12)產生的短鏈脂肪酸極少(0.6和0.9 mmol/L)。

3 結 論

1)里氏木霉以10 g/L的微晶纖維素為誘導物合成甘露聚糖酶，β-甘露聚糖酶和β-甘露糖苷酶酶活力分別為3.902和0.019 U/mL，酶活比為205.4∶1.0，可作為葡甘露聚糖酶法制備葡甘露低聚糖的專用酶制劑。里氏木霉以微晶纖維素為誘導物發酵，可同時誘導合成β-甘露聚糖酶、纖維素酶和木聚糖酶，β-甘露聚糖酶活力與纖維素酶、木聚糖酶酶活力均呈正相關性。

2)葡甘露聚糖在底物質量濃度15 g/L、酶用量10 U/g、50 ℃和pH 4.8條件下經β-甘露聚糖酶酶解8 h，葡甘露低聚糖得率為73.70%，酶對葡甘露低聚糖的選擇性為85.60%。

3)3 g/L葡甘露低聚糖對腸道微生物有選擇性增殖作用，對雙歧桿菌和乳桿菌的增殖作用顯著，對潛在致病菌平腸球菌(E.hiraeB-1295)、空腸彎曲菌(C.jejuniS107)和大腸桿菌(E.coliK12)幾乎無增殖作用，對長雙歧桿菌(B.longumATCC15697)和嗜酸乳桿菌(L.acidophilusB-4495)的增殖效果最好，分別增殖27.0和19.5倍；且發酵葡甘露低聚糖產生的短鏈脂肪酸最高，分別為(78.5±3.5)和(42.6±2.6) mmol/L，其中，乳酸和丁酸是主要的短鏈脂肪酸。