腎透明細胞癌組織和細胞系趨化素樣因子1的表達及其臨床意義

塔 拉， 宣成睿

(1.內蒙古自治區人民醫院泌尿外科， 呼和浩特 010017； 2.內蒙古醫科大學病理生理教研室， 呼和浩特 010059)

腎癌是泌尿系統常見的惡性腫瘤之一。2018年，國際癌癥研究中心的數據顯示：腎癌新發病例40.3萬例，死亡17.5萬例，分別居世界惡性腫瘤第14位和第16位[1]。在首次確診為腎癌的患者中，約有50%的腎癌患者可以得到早期診斷，20%～35%患者在初診時候已經發生遠處轉移。腎細胞癌(renal cell carcinoma, RCC)是起源于腎實質中腎小管上皮的惡性腫瘤，是成年人中最常見的腎癌，占90%～95%[2]。腎癌包括10多種組織學和分子亞型，其中腎透明細胞癌(clear cell RCC，ccRCC)最常見[3]。目前早期局部腎癌的治療以手術為主，但晚期腎癌患者的預后較差.越來越多的證據表明I期RCC患者的5年生存率為 80%～95%，而IV期 RCC患者的5年生存率急劇下降至10%以下，中位總生存期僅為10～15個月[4]。其主要原因是在治療方法上，腎癌對放療、化療均不敏感。腎細胞癌的新興療法，包括激酶抑制劑和免疫療法，正在改善患者的預后，也取得了這一進展，但仍有大量未滿足的需求，因為只有少數患者實現對免疫治療的完全反應[5-6]。截至目前，臨床上尚無用于腎癌早期臨床診斷的生物標志物投入使用。因此，探求腎癌的發病的分子機制、尋找腎透明細胞癌有效的診斷標志物，仍然是目前研究的熱點、難點。

趨化因子是一類8～13 kDa 的小分子量蛋白質。參與許多生物過程，包括血管生成、腫瘤生長和轉移以及白細胞的遷移。趨化因子可以調節免疫細胞運輸和淋巴組織生長，從而調節抗腫瘤免疫反應[7-8]。對腎癌的研究顯示：與正常組織相比12種趨化因子在腎癌組織中呈現差異性表達。CXC1/5/9/10/11/13的表達與RCC患者的病理分期存在顯著相關性。CXCL1/2/3/5/13 轉錄水平低的 RCC 患者與更好的預后相關[9]。趨化因子中，過度表達促炎細胞因子CXCL7可加速裸鼠ccRCC 腫瘤的生長，是總生存率的獨立預后因素[10]。趨化因子之間多具有20%～50%的同源性,即具有相同的基因序列和氨基酸序列。趨化素樣因子1(chemokine-like factor 1, CKLF1)是由北京大學首次成功克隆的一個細胞因子。目前研究顯示：CKLF1 對白細胞顯示出廣泛的趨化活性，并在炎癥和自身免疫性疾病中發揮重要作用[11-14]。CKLF1還與多種惡性腫瘤的發生以及不良預后相關，是一種有效且非常有前景的治療靶點[15]。腎透明細胞癌的發生與炎癥、免疫調節關系密切，CKLF1在腎透明細胞癌的發生、發展中是否發揮作用，尚鮮見報道。為此，研究CKLF1在腎透明細胞癌組織及腎癌細胞系中表達水平并分析其臨床意義，為腎透明細胞癌的臨床診斷、預后的判斷提供新的分子標志物。

1 實驗材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

人腎透明細胞癌細胞系ACHN、Caki、腎小管上皮細胞HKC細胞株購自北京協和醫學院基礎學院。 MEM培養基、MaCoy’5A培養基、D/F12 DMEM培養基、胎牛血清購自Gibco公司。CKLF1一抗、二抗購自Abcam公司。BCA蛋白質濃度檢測試劑盒購自Solarbio科學技術有限公司。逆轉錄試劑盒和RT-PCR試劑盒購自Fermentas公司。

1.1.2 臨床資料

選取2017—2018年在內蒙古自治區人民醫院行手術切除的36例腎透明細胞癌患者標本及其對應的癌旁腎組織標本32例。所有入組患者均無免疫系統疾病，未患其他腫瘤，術前均未接受治療。其中男19例，女17例，年齡在55～75 歲。臨床病理Fuhrman分級：I級11例，II級21例，III級4例。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養

ACHN細胞采用MEM培養基，Caki采用MaCoy’5A培養基,HKC采用D/F12 DMEM培養基，分別加入終濃度10%胎牛血清,置于細胞培養箱內常規培養。

1.2.2 免疫組化實驗

腎癌組織、癌旁組織取材后，經4%多聚甲醛固定、脫水、透明、包埋、切片、烤片處理后，按照免疫組化試劑盒說明書步驟處理切片，進行檢測。檢測中以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照。染色結果由兩位副高以上的病理醫師雙盲讀片得出。結果分析：在200倍顯微鏡下，隨機選取視野5個/張，記錄每個視野中陽性的細胞總數和細胞總數。陽性細胞的染色強度、陽性細胞所占的百分比判斷標準如表1所示。兩種積分相乘，對結果進行半定量判斷。低表達為0～6分，高表達為7～12分。

表1 陽性細胞染色強度和陽性細胞占比的評分標準Table 1 The scoring standards of the staining intensity of positive cells and the percentage of positive cells

1.2.3 Western blot 檢測CKLF1在細胞系ACHN，Caki、HKC中蛋白水平實驗方法

當6孔板中的細胞融合度達到80%時，利用RIPA細胞裂解液裂解細胞，裂解后進行總蛋白提取。蛋白濃度采用BCA(bicinchoninic acid)法用酶標儀進行測量。常規十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS PAGE)，轉膜，5%脫脂奶粉封閉。加入 CKLF1 一抗(1∶1 000)，4 ℃過夜。洗膜后加入二抗(1∶10 000)，使用Odyssey LI-COR紅外成像系統收集熒光信號。

1.2.4 Real-time PCR檢測CKLF1在細胞系ACHN，Caki、HKC基因轉錄水平實驗方法

提取待測細胞總RNA，按照試劑盒步驟進行逆轉錄實時定量PCR。反應體系 20 μL，定量PCR儀擴增反應條件設置：95 ℃變性10 min，95 ℃退火15 s，60 ℃延伸60 s，循環40次。GAPDH為內參，實驗重復3次取平均值，記錄循環域值Ct。采用ΔΔCt法對數據進行相對定量分析：公式改變倍數為2-ΔΔCt，ΔΔCt法=ΔCt(測試組)-ΔCt(正常細胞組)。引物序列如表2所示。

表2 CKLF1、GAPDH引物序列Table 2 CKLF1, GAPDH primer sequence

1.3 統計學分析

采用SPSS20.0軟件包進行數據的統計處理，各組計量資料以均數±標準差(mean±SD)表示。卡方檢驗方法分析免疫組化CKLF1在腎癌與癌旁組織以及細胞系中的表達差異；秩和檢驗Mann-Whitney U法分析CKLF1表達水平與臨床病理Fuhrman分級之間的關系；蛋白及mRNA的表達,多組數據之間均數的比較采用單因素方差分析。如果方差分析結果具有顯著性差異，組間方差齊則進一步采用最小顯著差異法比較兩兩之間的差異，如果組間方差不齊，則采用DunnettT3法分析兩兩之間的差異；指標間相關性以Pearson相關系數來表示，P<0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腎透明細胞癌與癌旁組織中CKLF1的表達情況

CKLF1在腎透明細胞癌組織中的表達水平與癌旁組織相比，差異具有顯著性 (P<0.05)，如表3、圖1所示。腎透明細胞癌組織中，CKLF1高表達者免疫組化染色呈棕黃色，在癌旁正常組織中表達普遍偏低。依據臨床病理Fuhrman分級：CKLF1表達水平的高低在臨床病理各分級之間無明顯差異(P>0.05)，如表4所示。

表3 CKLF1在組織中的表達情況Table 3 The expression of CKLF1 in tissues

圖1 CKLF1蛋白在透明細胞腎細胞癌及癌旁 組織中的表達情況Fig.1 CKLF1 protein expression in clear cell renal cell carcinoma and adjacent tissues

表4 CKLF1表達水平與病理分級的關系Table 4 The relationship between CKLF1 expression level and pathological grade

2.2 CKLF1細胞系ACHN、Caki、HKC中的表達情況

細胞爬片處理后，免疫組化結果顯示，CKLF1腎癌細胞系ACHN、Caki和腎小管上皮細胞HKC中均有表達，主要在胞漿著色，細胞膜亦有著色。CKLF1在ACHN和Caki中的表達與HKC不同，差異具有統計學意義(X2=8.182，P=0.017)，如圖2所示。兩兩比較結果顯示：與HKC細胞相比，Caki、ACHN中CKLF1的表達均明顯高于HKC，差異均具有統計學意義 (P<0.05)。ACHN與Caki相比，Caki中CKLF1的表達明顯高于ACHN，差異具有統計學意義X2=7.50，P=0.006)，且CKLF1在Caki細胞系中的表達量最高。

圖2 CKLF1蛋白在腎癌細胞ACHN、Caki和 腎小管上皮細胞HKC中的表達Fig.2 Expression of CKLF1 protein in renal carcinoma cell lines ACHN, Caki and renal tubular epithelial cells HKC

2.3 CKLF1在細胞系ACHN、Caki、HKC的蛋白表達情況

Western blot檢測結果顯示，CKLF1腎癌細胞系ACHN、Caki的蛋白表達水平明顯高于腎小管上皮細胞HKC如圖3(a)所示。與HKC相比較，CKLF1蛋白相對表達量如圖3(b)所示，差異有統計學意義(P<0.05)，如圖3所示。

*表示與HKC組相比較P<0.05圖3 CKLF1蛋白在腎癌細胞ACHN、Caki和 腎小管上皮細胞HKC中的表達Fig.3 Expression of CKLF1 protein in renal carcinoma cell lines ACHN, Caki and renal tubular epithelial cells HKC

2.4 CKLF1在細胞系中mRNA的表達水平

qRT-PCR結果顯示，在mRNA水平，CKLF1在腎癌細胞系ACHN、Caki的水平顯著高于腎小管上皮細胞HKC，差異有統計學意義(P<0.05)，如圖4所示。

*表示與HKC組相比較P<0.05圖4 腎細胞癌細胞株ACHN，Caki和腎小管上皮 細胞HKC中CKLF1 mRNA的表達量Fig.4 CKLF1 mRNA expression in renal cell carcinoma cell lines ACHN, Caki and renal tubular epithelial cells HKC

過去20年中，腎細胞癌的診斷和治療有所改善，但RCC仍然是最致命的泌尿外科惡性腫瘤之一[16]，并且截至目前仍缺乏有效的針對腎癌的全身療法[17]。腎癌發病機制極其復雜，目前尚未完全闡明。王永志等[18]在對腎透明細胞癌組織的研究發現：多種基因在腎透明細胞癌組織中表達出現失調，有的為上調，有的為下調，出現變化的基因主要參與免疫和炎癥反應以及細胞遷移等生物學過程。細胞微環境的變化與腫瘤的發生、進展密切相關[19]。腫瘤微環境主要由炎性細胞和基質組成，炎性細胞分泌的小分子活性物質對于腫瘤細胞的生物學行為具有重要影響[20]，在此過程中發揮作用的信號小分子的主要是細胞因子和趨化因子。

趨化因子是能使細胞發生趨化運動的一類細胞因子, 其結構相似。絕大多數趨化因子含有 4個保守的半胱氨酸, 根據前兩個半胱氨酸的相對位置不同, 趨化因子可分為 CXC(α)、CC(β)、C(δ)和 CX3C(γ)4個亞家族， C表示半胱氨酸, X表示任意氨基酸。趨化素樣因子1具有CC家族趨化因子的基本功能和結構特征，即連續兩個半胱氨酸的特征性結構和趨化功能[21]。CKLF1對單核細胞、淋巴細胞，參與炎性炎癥反應的中性粒細胞，均具有明顯的趨化作用[22]。在對小鼠肺炎的研究中觀察到：CKLF1參與了在肺部和支氣管的損傷與修復過程[23]，其作用機制是通過趨化并活化大量嗜中性粒細胞和免疫細胞而發揮作用。炎細胞活化后,釋放出大量炎癥介質，炎癥介質可激活核轉錄因子-κB (nuclear factor-κB，NF-κB) 信號通路，激活的NF-κB又可與多種炎癥因子基因啟動子中的特異性κB序列結合，參與炎癥因子，如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白細胞介素1β(interleukin 1β, IL-1β)、白細胞介素6(interleukin 6, IL-6)、趨化因子等基因轉錄，進而形成級聯放大效應損傷機體[24]。而炎癥細胞、免疫細胞的活化、聚集均與腎癌的發生密切相關[25-26]。各種研究顯示CKLF1不僅參與炎癥、免疫反應，在多種腫瘤發生、發展中也發揮著重要作用。趨化素樣因子1表現出兩大相反的作用: 一些腫瘤中CKLF1可能參與增強宿主抗腫瘤生長、浸潤的固有或特異性免疫反應, 另一些腫瘤中，CKLF1則可能通過促進腫瘤細胞的增殖和腫瘤組織中血管的生成, 從而促進腫瘤的生長和轉移。在非小細胞肺癌組織中,CKLF1表達下調，它可能是重要的抑癌基因[27]。在肝癌組織中，CKLF1的高表達與血管浸潤和不良生存相關,同時CKLF1可通過IL-6/STAT3信號通路抑制抑制肝癌細胞凋亡，促進肝癌的發生、轉移。CKLF1可能成為肝癌潛在的分子治療靶點[28]。熊英等[29]在對卵巢癌的研究結果顯示：CKLF1在卵巢上皮性腫瘤中的表達水平增高，高表達的CKLF1可能與卵巢上皮性腫瘤的轉移、不良預后相關。綜上所述，同一趨化素樣因子CKLF1在非小細胞肺癌、肝癌、卵巢癌中發揮了不同的生物學作用。研究結果顯示：在腎透明癌組織中，CKLF1的表達水平明顯高于癌旁正常組織，提示CKLF1在腎透明細胞癌的發生、發展過程中，可能發揮了重要的促進作用，其具體作用途徑有待進一步實驗驗證。研究結果顯示：CKLF1在腎透明細胞表達水平的高低，在臨床病理Fuhrman各分級之間無明顯差異，此結果提示CKLF1表達量與腎透明細胞癌的惡性程度關系不大，但同時也可能與本研究過程中，獲取的樣本量相對較少有關。此外，在對代表性腎癌細胞系的檢測發現，CKLF1在腎細胞癌代表癌細胞系ACHN、Caki中，mRNA表達水平和蛋白的表達水平，均明顯高于正常腎小管上皮細胞系HKC。

3 結論

通過對細胞因子CKLF1在腎透明細胞癌組織、癌旁組織、以及腎癌代表細胞系的表達情況的檢測以及和病理分型之間的關系分析，得出以下結論。

(1)CKLF1在腎透明細胞癌組織中表達明顯高于癌旁正常組織。CKLF1在腎透明細胞癌的發生、發展過程中可能扮演了重要促癌角色。CKLF1對腎癌發揮作用的具體信號通路，有待通過進一步實驗研究驗證。研究腎透明細胞癌的臨床診斷及判斷提供了新的依據,有望成為腎透明細胞癌新的臨床診斷的生物學標志物，為腎癌的診斷和治療提供了新的思路和方法。

(2)CKLF1在腎透明細胞癌代表細胞系ACHN、Caki中表達高于正常腎小管上皮細胞HKC。 而且在Caki細胞系中表達最高，Caki可作為CKLF1后續功能研究的代表細胞株。