逍遙散聯(lián)合維生素D對(duì)產(chǎn)后抑郁大鼠行為學(xué)及腦組織形態(tài)學(xué)的影響

鄭 舒，何 津，單延紅

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院產(chǎn)科，吉林 長(zhǎng)春 130021)

產(chǎn)后抑郁癥(Postpartum depression，PPD)是一種常見(jiàn)的婦科產(chǎn)后疾病。調(diào)查顯示，西方國(guó)家的分娩產(chǎn)婦產(chǎn)后PPD病發(fā)率在15%左右[1]。而我國(guó)產(chǎn)后患者PPD的發(fā)病率在20%左右[2]。其臨床主要以煩躁、沮喪、悲傷、易激怒以及抑郁等。大部分患者會(huì)在經(jīng)歷5個(gè)月左右的病程后恢復(fù)，也有60%左右的PPD患者恢復(fù)時(shí)間長(zhǎng)至1年[3]。PPD不僅僅會(huì)對(duì)患者婚姻、家庭以及產(chǎn)婦身體健康產(chǎn)生影響，嚴(yán)重者還可對(duì)孩子的健康成長(zhǎng)產(chǎn)生影響[4]。目前臨床上通常采用西醫(yī)進(jìn)行治療，包含有心理療法、激素補(bǔ)充治療、精神藥物治療等，主要以藥物結(jié)合心理療法綜合治療[5]。但由于長(zhǎng)期服用抗抑郁或者激素類藥物具有一定的不良反應(yīng)，而產(chǎn)婦需要撫育和哺乳嬰兒，故部分PPD患者不愿意進(jìn)行西醫(yī)治療[6]。有關(guān)研究顯示，逍遙散是一種可以調(diào)冶人體情志活動(dòng)的中醫(yī)經(jīng)典名方，對(duì)于產(chǎn)后抑郁具有較好的療效，但具體的臨床作用機(jī)制尚未明確[7]。故本文探討逍遙散聯(lián)合維生素D對(duì)產(chǎn)后抑郁大鼠行為學(xué)及腦組織形態(tài)學(xué)的影響，為產(chǎn)后抑郁的臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雌性SD大鼠，體重(198.25±8.54)g，月齡2～4個(gè)月，購(gòu)于南京卡文斯生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器和試劑

1.2.1 儀器：大鼠強(qiáng)迫游泳水缸(圓筒狀，水深35 cm、高度60 cm、直徑25 cm)；Digital Sight DS-U2圖像采集系統(tǒng)，購(gòu)于日本尼康公司；倒置式生物顯微鏡(CKX41S)，購(gòu)于日本奧林巴斯公司；旋轉(zhuǎn)石蠟切片機(jī)(Finesse325型)，賽默飛世爾儀器有限公司。

1.2.2 試劑：黃體酮注射液(國(guó)藥準(zhǔn)字H33020828)；苯甲酸雌二醇注射液(國(guó)藥準(zhǔn)字H44022008)；維生素D(國(guó)藥準(zhǔn)字H20113033)；逍遙散處方為薄荷、炙甘草各40 g，生姜60 g， 茯苓、 白術(shù)、白芍、當(dāng)歸、柴胡各100 g。7680 ml水煎煮2次，每次1 h，合并煎液，旋蒸煎液濃縮，并經(jīng)過(guò)噴霧干燥處理，得干粉171.5 g，臨床使用時(shí)將其按照1 g/ml配成干粉0.9%氯化鈉溶液。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 PPD造模方法[8]：對(duì)大鼠按照1.5 ml/kg的2%戊巴比妥鈉劑量進(jìn)行腹腔注射麻醉，無(wú)菌條件下，子宮結(jié)扎并將兩側(cè)的卵巢切除，為預(yù)防感染，可在窗口噴涂慶大霉素。術(shù)后2 d進(jìn)行陰道涂片，觀察大鼠的動(dòng)情周期改變，動(dòng)情前期、中期和后期顯微鏡下可見(jiàn)白細(xì)胞或者角化細(xì)胞；非發(fā)情期顯微鏡下可見(jiàn)少量的上皮細(xì)胞。顯微鏡結(jié)果顯示白細(xì)胞或者角化細(xì)胞，表明卵巢未完全切除，去除。

1.3.2 分組及給藥方法：去除建模不合格的15只大鼠，將其隨機(jī)分為空白組、模型組、維生素D組、聯(lián)合組四組，各50只。每組選定治療后1、2、4、6周為觀察點(diǎn)，每個(gè)觀察點(diǎn)設(shè)定大鼠10只。空白組大鼠給予0.5 ml/d 的芝麻油皮下注射，連續(xù)治療16 d，之后0.1 ml/d 的芝麻油皮下注射，連續(xù)治療7 d。模型組、維生素D組以及聯(lián)合組大鼠給予4 mg注射用黃體酮和0.1 mg苯甲酸雌二醇進(jìn)行治療，連續(xù)治療16 d，之后0.2 mg/d的苯甲酸雌二醇皮下注射治療，從而對(duì)懷孕狀態(tài)進(jìn)行模擬。第24天，對(duì)照組和模型組分別給予相應(yīng)容量的0.9%氯化鈉灌胃處理；維生素D組給予0.2 μg/(kg·d)的維生素D灌胃給藥；聯(lián)合組在維生素D組的基礎(chǔ)上外加20 ml/(kg·d)的逍遙散湯劑灌胃給藥。四組大鼠產(chǎn)后均給藥處理30 d。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 糖水消耗[9]：禁水處理24 h，之后讓各組大鼠進(jìn)行1%蔗糖水自由飲用1 h，對(duì)蔗糖水消耗量進(jìn)行計(jì)算。

1.4.2 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)(OFT)[10]：垂直活動(dòng)得分為大鼠直立的次數(shù)，水平活動(dòng)得分為動(dòng)物穿越方格的數(shù)量為準(zhǔn)。每次測(cè)定之前將敞箱內(nèi)保持整潔，5 min/次，對(duì)每只大鼠的垂直活動(dòng)和水平活動(dòng)得分進(jìn)行記錄。

1.4.3 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)(FST)[11]：每只大鼠在水溫24～25 ℃條件下進(jìn)行預(yù)游泳，擦干，28 ℃ 30 min后，置于籠中。1 d后進(jìn)行正式的FST試驗(yàn)，記錄大鼠在5 min之內(nèi)，不動(dòng)狀態(tài)的時(shí)間總和。

1.4.4 神經(jīng)遞質(zhì)水平：最后給藥結(jié)束1 d后，斷頭處理，冰浴條件下對(duì)雙側(cè)海馬進(jìn)行剝離，清洗后，稱重，液氮保存。取10大鼠樣本，采用酶聯(lián)免疫吸附法對(duì)大鼠海馬組織中多巴胺(DA)、5-羥色胺(5-HT)、去甲腎上腺素(NE)神經(jīng)遞質(zhì)的水平，試劑盒購(gòu)于上海江萊生物，操作方法嚴(yán)格按照說(shuō)明書執(zhí)行。

1.4.5 腦組織病理形態(tài)觀察：每組10只大鼠，在1、2、4、6周時(shí)間點(diǎn)對(duì)其腦組織形態(tài)學(xué)進(jìn)行觀察。大鼠斷頭處理，立即取出腦，將其置于相同灌注液的瓶中進(jìn)行2周時(shí)間的固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片處理。常規(guī)HE染色后，在光學(xué)顯微鏡下對(duì)大鼠腦組織形態(tài)學(xué)進(jìn)行觀察。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.00統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)上述資料進(jìn)行整理分析，其中計(jì)量資料采用正態(tài)性檢驗(yàn)，行t檢驗(yàn)，多組組間比較行單因素方差分析，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠各時(shí)點(diǎn)蔗糖水消耗量 空白組、維生素D組和聯(lián)合組大鼠蔗糖水消耗量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，模型組逐漸下降。與空白組相比，相同時(shí)間點(diǎn)，模型組、維生素D組和聯(lián)合組的蔗糖水消耗量均明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組相比，聯(lián)合組、維生素D組第2、4、6周的蔗糖水消耗量明顯升高，且聯(lián)合組大鼠升高更為顯著(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠各時(shí)點(diǎn)蔗糖水消耗量(g)

2.2 各組大鼠各時(shí)點(diǎn)OFT水平得分 空白組、維生素D組和聯(lián)合組大鼠OFT水平得分呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，模型組逐漸下降。與空白組相比，相同時(shí)間點(diǎn)，模型組、維生素D組和聯(lián)合組的OFT水平得分均明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組相比，聯(lián)合組、維生素D組第2、4、6周的OFT水平得分明顯升高，且聯(lián)合組大鼠升高更為顯著(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠各時(shí)點(diǎn)OFT水平得分(分)

2.3 各組大鼠各時(shí)點(diǎn)OFT垂直得分 空白組、維生素D組和聯(lián)合組大鼠OFT垂直得分呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，模型組逐漸下降。與空白組相比，相同時(shí)間點(diǎn)，模型組、維生素D組和聯(lián)合組的OFT垂直得分均明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組相比，聯(lián)合組、維生素D組第2、4、6周的OFT垂直得分明顯升高，且聯(lián)合組大鼠升高更為顯著(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠各時(shí)點(diǎn)OFT垂直得分(分)

2.4 各組大鼠各時(shí)點(diǎn)FST 不動(dòng)時(shí)間 空白組、維生素D組和聯(lián)合組大鼠FST 不動(dòng)時(shí)間呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，模型組逐漸上升。與空白組相比，相同時(shí)間點(diǎn)，模型組、維生素D組和聯(lián)合組的FST 不動(dòng)時(shí)間均明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組相比，聯(lián)合組、維生素D組第2、4、6周的FST 不動(dòng)時(shí)間明顯降低，且聯(lián)合組大鼠升高更為顯著(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 各組大鼠各時(shí)點(diǎn)FST 不動(dòng)時(shí)間(s)

2.5 各組大鼠治療完成后海馬中5-HT、NE、DA含量變化 與空白組相比，模型組、維生素D組及聯(lián)合組大鼠海馬組織中5-HT、NE、DA含量均明顯較低(P<0.05)。與模型組相比，維生素D組及聯(lián)合組大鼠海馬組織中5-HT、NE、DA含量均明顯升高，且聯(lián)合組升高更為顯著(P<0.05)。見(jiàn)表5。

表5 各組大鼠治療完成后海馬中5-HT、NE、DA含量變化(nmol/L)

2.6 各組大鼠腦組織形態(tài)學(xué)觀察 經(jīng)HE染色，切片觀察顯示，空白組大鼠的海馬CA2區(qū)細(xì)胞密度大，數(shù)量多，細(xì)胞層排列較為緊密整齊，核仁清晰可見(jiàn)，胞漿飽滿，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整。模型組大鼠在第6周時(shí)，呈現(xiàn)一定程度的損傷，細(xì)胞間隙變大，數(shù)量減少，細(xì)胞稀疏紊亂，細(xì)胞層變薄，結(jié)構(gòu)也相對(duì)不完整，且多數(shù)呈現(xiàn)一定萎縮狀態(tài)，部分細(xì)胞呈現(xiàn)空泡化，細(xì)胞核變小，或可見(jiàn)細(xì)胞核碎裂、腫脹、淡染，嚴(yán)重者可呈現(xiàn)嗜酸性染色。維生素D組第6周時(shí)，細(xì)胞核以及其他細(xì)胞結(jié)構(gòu)有一定改善，空泡化和核固縮現(xiàn)象減少，核仁清晰，細(xì)胞膜相對(duì)較為完整。聯(lián)合組大鼠在第6周時(shí)，細(xì)胞數(shù)量明顯增加，核固縮及細(xì)胞空泡化明顯改善，排列基本整齊，病理形態(tài)恢復(fù)狀態(tài)與空白組相似，但與正常狀態(tài)仍有一定差異(圖1)。

圖1 各組大鼠治療第6周時(shí)腦組織病理形態(tài)(HE染色，×200)

3 討 論

PPD是一種復(fù)雜情緒障礙型的抑郁癥，但由于其發(fā)病的病理復(fù)雜性和生理特殊性，致使本病的模型建設(shè)方面與傳統(tǒng)意義上的抑郁癥存在一定的差異[12]。目前，臨床上大都公認(rèn)激素模擬妊娠(HSP)后激素停撤實(shí)驗(yàn)是PPD模型的建立方法，國(guó)內(nèi)外研究較為廣泛。其在一定程度上滿足了動(dòng)物模型的基本要求，即行為表現(xiàn)的模擬性；理論基礎(chǔ)的合理性；藥物治療的有效性；反映人體病理生理學(xué)和生物學(xué)性狀改變，與人類PPD疾病具有相似性[13-14]。本文通過(guò)PPD大鼠模型的建立，為臨床試驗(yàn)提供平臺(tái)，以期對(duì)PPD發(fā)病病機(jī)病因進(jìn)行探討。目前，多項(xiàng)臨床研究顯示，PPD患者大都存在一定程度的腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)含量降低的，受體敏感性降低的現(xiàn)象，遞質(zhì)系統(tǒng)失衡[15-16]。而海馬是大腦的一個(gè)重要組織系統(tǒng)，也是一個(gè)易受損且對(duì)應(yīng)激反應(yīng)較為敏感的結(jié)構(gòu)區(qū)域。海馬腦區(qū)含有豐富的神經(jīng)遞質(zhì)和各種激素，用于調(diào)節(jié)機(jī)體的行為、記憶和學(xué)習(xí)以及情緒等[17]。大鼠海馬組織內(nèi)的相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)水平與PPD的發(fā)病機(jī)制關(guān)系密切。DA是一種獨(dú)立性的神經(jīng)遞質(zhì)，也是NE的前體。DA除了可以通過(guò)神經(jīng)元對(duì)軀體運(yùn)動(dòng)進(jìn)行調(diào)節(jié)外，還可調(diào)節(jié)推理、理解、思維、認(rèn)知以及情感等精神活動(dòng)，DA的失活會(huì)一定程度造成抑郁癥的發(fā)生[18]。NE和5-HT主要調(diào)節(jié)性功能、食欲、記憶、警覺(jué)、睡眠以及情感，是與人類行為關(guān)系密切的神經(jīng)遞質(zhì)[19]。文中結(jié)果顯示，逍遙散治療的聯(lián)合組大鼠海馬組織DA、NE、5-HT含量明顯升高，說(shuō)明了逍遙散可以明顯改善PPD大鼠的海馬組織的神經(jīng)遞質(zhì)水平。這可能主要是由于逍遙散是一種含有茯苓、柴胡、白芍等8味中藥的復(fù)方，作用靶點(diǎn)較多，其中柴胡可以明顯升高肝郁證大鼠的腦內(nèi)DA和NE水平，茯苓可以誘導(dǎo)5-HT的合成分泌，進(jìn)而對(duì)PPD大鼠的海馬組織神經(jīng)遞質(zhì)水平進(jìn)行調(diào)節(jié)[20]。

文中行為學(xué)研究結(jié)果說(shuō)明了正常大鼠由于具有較為明顯的蔗糖水飲用快感，消耗量相對(duì)較大；FST不動(dòng)時(shí)間則較短；PFT垂直和水平活動(dòng)得分相對(duì)較高。而模型組大鼠蔗糖水消耗量呈現(xiàn)降低趨勢(shì)；FST不動(dòng)時(shí)間明顯延長(zhǎng)；OFT垂直和水平活動(dòng)得分顯著降低。而經(jīng)過(guò)逍遙散治療的聯(lián)合組大鼠各個(gè)方面的行為學(xué)指標(biāo)改善顯著，尤其是在第4周和第6周時(shí)，行為學(xué)的回復(fù)狀態(tài)更為接近大鼠的正常水平。海馬組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)損傷時(shí)，會(huì)引起機(jī)體相關(guān)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)因子以及相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)的變化，進(jìn)而誘導(dǎo)抑郁癥的產(chǎn)生，與文中海馬組織DA、NE、5-HT含量變化結(jié)果相符。另外相關(guān)研究表明，PPD模型大鼠海馬組織出現(xiàn)較多的胞核脫失，神經(jīng)元細(xì)胞排列紊亂，數(shù)目明顯減少，胞核碎裂、腫脹，甚至出現(xiàn)核固縮。文中結(jié)果表明，正常大鼠海馬組織細(xì)胞核仁清晰，胞漿飽滿，細(xì)胞數(shù)量多，排列整齊且結(jié)構(gòu)完整；而模型大鼠細(xì)胞核縮小，呈現(xiàn)萎縮，有的細(xì)胞有核固縮出現(xiàn)，而經(jīng)過(guò)逍遙散治療后，尤其是在第4周和第6周時(shí)，大鼠腦組織形態(tài)學(xué)恢復(fù)較好。這可能是由于逍遙散通過(guò)改善海馬組織中相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)的調(diào)節(jié)，對(duì)其行為學(xué)和腦組織形態(tài)學(xué)進(jìn)行改善。

綜上所述，逍遙散聯(lián)合維生素D可顯著改善產(chǎn)后抑郁大鼠的各項(xiàng)行為學(xué)指標(biāo)，提高海馬組織神經(jīng)遞質(zhì)的含量，對(duì)腦組織損傷具有一定恢復(fù)效果，具有較高的臨床參考價(jià)值。