電針對創傷性顱腦損傷大鼠炎癥因子表達及神經功能的影響

李 娜，王瑞輝，郭 婕，李 華，郭新榮，張容超，吳 濤

(陜西中醫藥大學針灸推拿學院，陜西 咸陽 712046)

創傷性顱腦損傷(Traumatic brain injury,TBI)是目前神經外科臨床最常見的疾病之一，隨著社會的發展變化，其發病率呈現逐年升高的特點；又因其致死率高、致殘率高、患病人群多為中青年，給家庭和社會帶來很大的心理和經濟負擔。TBI 后腦神經細胞的生理病理變化過程十分復雜，主要包括神經細胞死亡[1]、腦水腫[2]、氧化應激[3]、興奮性神經遞質毒性釋放[4]、神經炎癥[5]、血腦屏障障礙[6]等。其中TBI后血腦屏障破壞、凝血功能障礙、氧化應激等因素可引起的炎癥反應是引起TBI后腦水腫的主要原因[7]，有效的控制腦神經細胞的炎癥反應和腦水腫對TBI患者的預后及康復起著重要的作用[8]。本研究主要探討電針對創傷性顱腦損傷大鼠血清及大腦組織中腫瘤壞死因子(TNF-α)和白細胞介素(IL-1β、IL-6)等表達及神經功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 SPF級SD大鼠66 只(雄性，6～8周齡)，體重180～220 g，購買于西安交通大學醫學部實驗動物中心[生產許可證號：SCXK(陜)2018-001]。將實驗大鼠適應性喂養7 d，在陜西中醫藥大學針藥結合動物飼養中心進行分籠喂養，濕度(54±2)%，溫度(23±3)℃，晝夜節律12 h/12 h，自由飲水攝食。適應性喂養結束后，隨機分為正常對照組12只、假手術組12只、模型組21 只及電針組21只，正常對照組和假手術組每組6只用于腦含水量測定，其余6只用于Elisa和Western blot檢測，電針組、模型組再需根據干預和取材時間的不同，又分為1、3、7 d 3個亞組(每亞組7 只)。

1.2 造模方法 在大鼠左側頂葉采用改良 Feeney’s自由落體打擊法[9]進行TBI 模型制備。假手術組、電針組及模型組大鼠三組均進行術前麻醉，麻醉劑量為：10%水合氯醛(3.8 ml/kg)，腹腔注射，麻醉起效后，剔除施術部位毛發后，將大鼠固定于腦立體定位儀上，以頭部正中線中點左側 0.5 cm 處為中心，縱行切開頭部皮膚 1.5 cm。使施術部位顱骨充分暴露后，用電磨鉆鉆一直徑 5 mm 的小孔，坐標位置：冠狀縫后0.6 cm、矢狀縫左側旁開0.5 cm，將20 g砝碼從50 cm高的透明玻璃管孔上端垂直下落擊打小孔，制備大鼠左側大腦頂葉TBI中度顱腦損傷模型。待大鼠蘇醒后，對造模大鼠神經功能進行評分，量表使用改良神經功能缺損量表(Modified neurological severity scale，mNSS)，以評定大鼠即時神經功能，評分為 7～12 分，則認定為造模成功。造模后連續3 d，腹腔注射慶大霉素(0.2 ml/kg)以抗感染。假手術組大鼠只開顱鉆孔，不打擊。造模過程中和造模后，大鼠共死亡6只(電針組3只，模型組3只)。

1.3 干預方法 本實驗采用電針進行干預，穴位選取參照《大鼠穴位圖譜的研制》[10]，選取“水溝”“百會”，雙側“內關”“足三里”穴，于造模后 24 h對電針組進行電針干預。選用一次性針灸針(規格：0.30 mm×25 mm)，“百會”穴：斜刺，深度為2 mm,“水溝”穴：點刺 30 s，深度為1 mm；“內關”穴，直刺，深度為 1 mm， “足三里”穴：直刺，深度為 7 mm；針刺得氣后，“足三里”和“內關”穴接連電針，波形為：斷續波，頻率為：2 Hz，留針15 min；1次/d，不同亞組分別干預1、3、7 d。模型組和假手術組，兩組大鼠每天模擬針刺前的操作：抓取、固定 15 min，正常對照組不進行干預。

1.4 主要試劑與儀器 大鼠TNF-α抗體、 IL-6抗體、IL-1β抗體購自博士德生物工程公司，批號分別為：PB0082、PB0061、PB0055)；羊抗兔 IgG(H+L)購自上海碧云天生物技術有限公司，批號為：A0208；大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6酶聯免疫吸附檢測(ELISA)試劑盒購于博士德生物工程有限公司，批號分別為:EK0421、EK0526、EK0393)；水合氯醛購于上海山浦化工有限公司；SDZ-Ⅱ電子針療儀(蘇州醫療用品廠有限公司)，腦立體定位儀(成都泰萌軟件有限公司)，SpectraMax5 酶標儀(美國 Molecular Devices 公司)。

1.5 行為學檢測 采用改良神經功能缺損量表(mNSS )[11]進行大鼠的神經功能的評估。每組大鼠均根據神經功能缺損量表進行運動、感覺和平衡訓練，并于術后 1、3 、5、7 d 記錄其mNSS 評分，分別從4 個方面：運動、感覺、平衡、反射進行神經功能綜合評估。總分 共18 分，評分越高(低)代表神經功能損傷程度越重(輕)，0 分為完全正常。

1.6 大鼠腦組織含水量檢測 采用干濕重法測定腦組織含水量[12]，每組于第3天隨機選取6只大鼠斷頭處死，取左側腦組織，電子天平(精確度 0.1 mg)測得濕重，然后置于70 ℃的烤箱內烘干48 h，恢復室溫后，測得干重。腦組織水含量=(濕重-干重) /濕重×100%[12]。

1.7 炎癥因子表達檢測 大鼠10%水合氯醛(3.8 ml/kg)腹腔注射麻醉后腹主動脈取血，室溫凝固2 h，離心15 min (3000 r/min)，收集血清待測。嚴格按照武漢博士德生物有限公司炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6 試劑盒的說明書操作步驟進行操作。

1.8 蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測損傷腦組織中IL-1β、TNF-α、IL-6蛋白表達 取損傷腦組織樣本100 mg，加 500 μl含蛋白酶抑制劑的 RIPA 裂解液后進行勻漿，提取總蛋白，金屬浴 95 ℃變性5 min。SDS-PAGE(12%) 凝膠電泳后，將蛋白轉移到PVDF膜，用脫脂奶粉(5%)封閉 2 h后，一抗孵育(4 ℃過夜)，抗體稀釋比例為：TNF-α 1∶2000，IL-6 1∶1000，IL-1β 1∶1000，β-actin 1∶1000；孵育二抗。滴加發光液，ECL 發光成像系統曝光拍照，計算并分析各目標蛋白相對表達量。

2 結 果

2.1 各組大鼠的一般情況比較 見表1～3。正常對照組、假手術組大鼠在實驗期間精神狀態良好、毛色光滑、反應靈活、自主飲水飲食、食量無減少，體重明顯增加；模型組大鼠手術后1～3 d，可見精神懶惰，飲食量明顯減少，體重減輕；電針組大鼠術后1～3 d在食量和體重方面有所減少；3～7 d模型組、電針組大鼠在飲食、飲水、體重增加均有所好轉，電針組較模型組明顯好轉，有統計學差異(P<0.05)。

表1 四組大鼠飲食量比較(g/d)

表2 四組大鼠飲水量比較(ml/d)

表3 四組大鼠體重比較(g/d)

2.2 各組大鼠行為學比較 見表4。各組大鼠在造模前mNSS評分比較無統計學差異，電針組和模型組在造模后 6 h、1 d mNSS評分相比較，差異無統計學意義(P>0.05)；電針治療后(3 d、7 d)，與模型組相比較，電針組mNSS評分降低明顯，差異有統計學意義(P<0.05，P<0.01)。

表4 各組大鼠電針干預后mNSS評分比較(分)

2.3 各組腦組織水含量比較 相比較于正常對照組，假手術組的大鼠腦組織含水量較低，差異無統計學意義(P>0.05);相比較于假手術組，模型組大鼠損傷腦組織含水量升高明顯(P<0.05)；相比較于模型組，電針組大鼠損傷腦組織含水量顯著降低(P<0.05)。見表5。

表5 四組大鼠TBI后3 d腦組織水含量比較(%)

2.4 各組大鼠血清炎癥因子指標比較 相比于正常對照組，假手術組大鼠血清炎癥因子IL-1β、TNF-α、IL-6的含量略有升高，差異無統計學意義(P>0.05),相比于假手術組，模型組大鼠血清炎癥因子(模型組)IL-1β、IL-6、TNF-α的含量顯著升高(P<0.05);相比于模型組，電針組大鼠血清炎癥因子IL-1β、TNF-α、IL-6的含量明顯降低。見表6。

2.5 各組大鼠損傷腦組織中炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白表達量的比較 Western blot 法檢測顯示，相比于正常對照組，假手術組大鼠大腦組織中TNF-α蛋白表達量有所升高(1 d，P<0.05，7 d，P>0.05)；相比于假手術組，模型組大鼠1、7 d 時損傷腦組織TNF-α蛋白表達量均明顯升高(P<0.05)；相比于模型組，電針組大鼠電針干預后損傷腦組織TNF-α表達量有所升高(1 d，P>0.05),表達量降低(7 d，P<0.05)；大鼠大腦組織IL-6在術后1、7 d蛋白量表達，相比于假手術組，正常對照組表達量較低(P<0.05)，模型組表達量升高較為明顯(P<0.05)；相比于模型組，電針組大鼠電針干預后1 d腦組織IL-6表達量有所增加，無統計學意義(P>0.05)，干預7 d大腦組織IL-6表達量明顯降低(P<0.05)；大鼠大腦組織IL-1β在術后1、7 d蛋白量表達，相比于假手術組，模型組表達量顯著增加(P<0.05)；相比于模型組，電針組大鼠腦組織IL-1β表達量降低較明顯(圖1)。

表6 各組大鼠干預后血清IL-1β、TNF-α、IL-6含量比較(pg/ml)

注：術后1 d、7 d各組損傷大腦組織TNF-α、IL-6、IL-1β蛋白表達情況(A圖、B圖)，術后1 d、7 d各組損傷大腦組織TNF-α含量比較(C圖),術后1 d、7 d各組損傷大腦組織IL-6含量比較(D圖),術后1 d、7 d各組損傷腦組織IL-1β含量比較(E圖)。

3 討 論

TBI的損傷一般分為原發性損傷和繼發性損傷，其中原發性損傷為機械外力所造成的腦組織結構損傷，是外力對腦組織的直接損傷，具有不可控性；繼發性損傷是從原發性損傷開始時起，腦部組織、血管等由于微環境的變化所引起的病理生理過程。根據原發性損傷和繼發性損傷的特點，學界認為有效控制繼發性損傷是決定顱腦損傷患者預后轉歸的關鍵。顱腦損傷發生后，以腦水腫、神經炎癥為代表的繼發性腦損傷是影響TBI患者康復的重要因素之一，但目前尚無有效治療方案[13]。

TBI后腦組織局部受損，局部及全身的炎癥反應迅速被激活，小膠質細胞及星形膠質細胞首先被激活，進而產生大量如：TNF-α、IL-6等炎性因子,激活后的炎性細胞進入腦組織后可以再次重新釋放炎癥因子，導致血腦屏障破壞,誘發腦水腫,導致顱腦損傷[14-15]。研究表明，在顱腦損傷后，血清中IL-6、IL-1β、TNF-α 等與腦內及全身炎癥密切相關的炎癥因子水平明顯升高[16-17]。

針灸作為中國傳統特色療法之一，在神經系統疾病的治療中療效顯著。TBI作為神經外科常見病、多發病，針灸對其治療和研究中，選取優勢穴位“百會、水溝、內關、足三里”等穴位，或結合藥物、穴位注射、神經肌肉電刺激、高壓氧、康復訓練等，在改善TBI后神經功能、認知功能、昏迷等方面具有良好的臨床療效[18-20]。由于TBI的病理生理過程較為復雜，對其針灸作用機制的研究目前還處于初步階段，研究表明，在TBI繼發性損傷早期的炎癥反應中，白細胞介素和TNF-α 在其中起著非常重要的作用，而中醫針灸能明顯減少炎癥因子在大腦組織中的含量，抑制大腦水腫，發揮有效保護神經元作用[21]。

本研究從電針對顱腦損傷后炎癥因子及蛋白的表達入手，選取腦損傷急性期的1、7 d為時間點，觀察各組大鼠腦組織及血清中炎癥因子及蛋白的表達的情況。結果顯示：在早期，損傷大腦組織及血清中的炎癥因子IL-1β、TNF-α、IL-6表達急劇升高，而后逐漸降低，在治療7 d后表達水平有所降低，而且，電針組TNF-α、IL-6、IL-1β表達量均明顯低于相同時間段的模型組，這與行為學等檢測結果變化是一致的。因此，電針“百會、水溝、內關、足三里”穴可明顯改善創傷型顱腦損傷大鼠的神經功能，減輕損傷大腦組織的炎癥反應，其相關機制可能與下調損傷大腦組織及血清中IL-6、IL-1β、TNF-α的表達，進而抑制炎癥反應，改善腦水腫有關。