內脂素通過PI3K/Akt/FoxO1信號通路對糖尿病KKAy小鼠骨骼肌糖脂代謝及胰島素抵抗的影響

楊 丹姚 衢張 晗張 琳王 茜廖 鑫章 瑩李思成高 琳*

(1.遵義醫科大學附屬醫院內分泌科，貴州 遵義 563003；2.川北醫學院附屬醫院健康管理中心，四川 南充 637000)

內脂素(Visfatin)是一種主要表達于內臟脂肪組織和(或)巨噬細胞的脂肪因子[1]，可增加骨骼肌細胞中葡萄糖的轉運，促進葡萄糖攝取[2]。研究表明Visfatin在葡萄糖代謝和胰島素敏感性方面發揮作用，可能參與了2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)、胰島素抵抗(insulin resistance，IR)、肥胖、代謝綜合征和多囊卵巢綜合征等疾病的發生發展[3－5]。叉頭框轉錄因子1(forkhead box transcription factor 1，FoxO1)在骨骼肌中高表達，當蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)磷酸化后，FoxO1的乙酰化以及泛素化等其他翻譯后修飾與磷酸化相互作用，從而影響其轉錄[6]。丙酮酸脫氫酶激酶4(pyruvate dehydrogenase kinase 4，PDK4)是FoxO1的下游靶基因，能夠調控糖酵解和糖異生途徑。研究證實Visfatin可通過調控PI3K/Akt信號途徑下游分子糖原合成酶激酶3β和葡萄糖轉運體4的活性而促進細胞對葡萄糖的攝取，改善糖脂代謝和IR[7－8]，但Visfatin是否能作用于PI3K/Akt下游FoxO1/PDK4通路而在糖脂代謝及IR中發揮作用，目前鮮有報道。因此，本研究擬探討Visfatin在PI3K/Akt/FoxO1信號通路中對糖脂代謝及胰島素敏感性的影響，旨在為防治糖尿病及IR相關疾病提供新的研究思路。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

10只8周齡SPF級雄性KKAy小鼠，體重為30.0 g左右，20只同周齡SPF級雄性C57BL/6J小鼠，體重為(20.0±2.0)g，連同高脂飼料均購于北京華阜康有限公司[SCXK(京)2019-0008]，普通飼料由重慶騰鑫公司提供，喂養于重慶醫科大學實驗動物中心[SYXK(渝)2018-0003]，給予充足飼料和自由飲水，環境溫度(23±2)℃，濕度40%~60%，控制光照時間8:00~20:00。動物實驗經遵義醫科大學附屬醫院動物實驗倫理委員會審核批準(KLLY-2018-075)，并嚴格遵循實驗動物使用的3R原則。

1.2 主要試劑與儀器

Visfatin重組蛋白(以色列PROSPEC公司)；蛋白濃度測定試劑盒、蛋白裂解液及磷酸酶抑制劑(美國Thermo公司)；脫脂奶粉、兔抗PI3K110α抗體、兔抗Akt抗體、兔抗p-Akt(Ser473)抗體、兔抗FoxO1抗體、兔抗p-FoxO1(Ser256)抗體及兔抗GAPDH抗體(美國CST公司)；兔抗PDK4抗體、兔抗G6Pase抗體及兔抗PEPCK抗體(美國abcam公司)；SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5×)及SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(江蘇碧云天生物公司)；諾和靈R(丹麥諾和諾德)；DEPC水(生工生物工程(上海)股份有限公司)；TRIzol試劑(TaKaRa公司)；cDNA逆轉錄試劑盒和2×SYBR Green qPCR master Mix(美國Bimake公司)；戊巴比妥鈉(美國Sigma公司)和胰島素試劑盒(江蘇博深生物科技有限公司)；膠成像系統(德國Analytik Jena公司)；電泳槽及轉移槽(美國BIO-RAD公司)；核酸蛋白濃度測定儀(杭州ALLSHENG公司)；雅培血糖儀及配套試紙(英國Abbott公司)；全自動生化儀(日本Olympus公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 造模及分組

C57BL/6J小鼠按照隨機數字表分為普通飼料組和高脂飼料組，喂養8周后，C57BL/6J小鼠普通飼料組隨機分為普食(ND)組和普食＋內脂素(ND＋V)組，高脂飼料組隨機分為高脂(HFD)組和高脂＋內脂素(HFD＋V)組；KKAy小鼠給予高脂飼料喂養8周后，連續2次空腹血糖(FBG)≥13.9 mmol/L定義為糖尿病模型[9]，成模后的KKAy小鼠隨機分為糖尿病(DM)組和糖尿病＋內脂素(DM＋V)組；ND＋V組、HFD＋V組和DM＋V組連續3 d腹腔注射重組內脂素蛋白(6μg/kg)[8]，其余各組腹腔注射等量生理鹽水，并于注射前后測定相關指標(n＝5)。

1.3.2 葡萄糖耐量實驗(GTT)和胰島素耐量實驗(ITT)

GTT:將小鼠禁食12 h，測定FBG后腹腔注射2 g/kg的20%葡萄糖溶液，于注射后15、30、60、90、120和180 min尾靜脈取血測血糖，并計算GTT曲線下面積(AUCGTT)[10]。GTT實驗結束間隔1周后行ITT:將小鼠禁食6 h，然后腹腔注射0.75 U/kg的0.1 U/mL胰島素溶液后，測定6個時間點(0、15、30、60、90和120 min)血糖水平并計算AUCITT[11]。

1.3.3 標本的采集

小鼠禁食后按50 mg/kg體重腹腔注射戊巴比妥鈉溶液麻醉，取血，室內靜置30 min，3000 r/min離心15 min，移液器吸取上清于EP管中，－80℃超低溫冰箱保存。打開胸腹腔，用預冷的生理鹽水心臟灌注，直至肝變白為止，游離后肢骨骼肌組織，生理鹽水洗凈，濾紙吸干后存放于凍存管，于液氮中保存。

1.3.4 基礎指標的測定

每周定期測定各組小鼠體重和攝食；采用血糖儀測定FBG(禁食6 h)和餐后血糖(PBG)；采用全自動生化儀檢測小鼠血清中的甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)以及游離脂肪酸(FFA)；采用酶聯免疫吸附實驗測定小鼠空腹血清胰島素(FIns)；并計算穩態模型評估胰島素抵抗指數(HOMA-IR)，公式為(FBG×FIns)/22.5。

1.3.5 RT-qPCR反應

用TRIzol提取骨骼肌組織總RNA，逆轉錄合成cDNA，SYBR-Green熒光染料RT-qPCR檢測骨骼肌組織的 mRNA 表達。PI3K 上游引物 5’-CCCATGGGACAACATTCCAA-3’，下游引物5’-CATGG CGACAAGCTCGGTA-3’；Akt上游引物5’-TCAGGATGTGGATCAGCGAGA-3’，下游引物5’-CTGCAGGCAGCGGATGATAA-3’；FoxO1上游引物5’-AGAGTTAGTGAGCAGGCTACAT-3’，下 游引物5’-CCGCTGTTGCCAAGTCTGA-3’；β-actin上游引物5’-GGTGGGAATGGGTCAGAAGG-3’，下游引物5’-AGGTCTCAAACATGATCTGGGT-3’。

1.3.6 Western blot檢測

各組取適量骨骼肌組織置于冰上的勻漿器中，加入蛋白裂解液和蛋白磷酸酶抑制劑(100∶1)充分研磨，直至乳糜狀后轉移到EP管中，每隔5 min振蕩1次，共30 min，4℃離心10 min，吸取上清測定總蛋白濃度。另取上清與5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液混合后沸水變性5 min，按照每孔40μg蛋白上樣進行電泳分離，轉膜，5%脫脂奶粉封閉，一抗(濃度為1∶1000~1∶2000)4℃孵育搖床過夜，TBST溶液洗膜3次，加入二抗(濃度為1∶10000)室溫孵育1 h，洗膜后用ECL曝光顯影，VisionWorks軟件進行分析條帶的灰度值。

1.4 統計學方法

所有數據用平均數±標準差(±s)表示，用SPSS 25.0軟件進行分析，用GraphPad Prism 7和Photoshop軟件進行作圖。多組間比較用單因素方差分析，兩組間比較方差齊時用LSD檢驗，方差不齊時用Dunnett’s T3檢驗，P<0.05有統計學意義。

2 結果

2.1 造模8周后各組小鼠的體重、攝食和血糖

在喂養8周后，與ND組比較，HFD組和DM組小鼠體重顯著增高，DM組小鼠的攝食顯著增高；與HFD組比較，DM組小鼠體重和攝食均顯著增高(P<0.01)。與ND組和HFD組比較，DM組的FBG和PBG顯著增高(P<0.001)。見表1。

表1 喂養8周后三組小鼠的體重、攝食及血糖(±s，n＝5)Table 1 Body weight，food intake and blood glucose in the three groups of mice after 8 weeks of feeded

表1 喂養8周后三組小鼠的體重、攝食及血糖(±s，n＝5)Table 1 Body weight，food intake and blood glucose in the three groups of mice after 8 weeks of feeded

注:與ND組相比，a P<0.01，b P<0.001；與HFD組相比，c P<0.001。Note.Compared with ND group，a P<0.01，b P<0.001.Compared with HFD group，c P<0.001.

指標Index普食組ND group高脂組HFD group糖尿病組DM group體重(g)Body wight 24.90±0.87 30.57±1.11a 41.12±1.58bc攝食(g/d)Food intake 2.51±0.27 2.22±0.17 7.05±0.36bc空腹血糖(mmol/L)FBG 5.76±0.92 7.60±1.03 25.68±6.41bc餐后血糖(mmol/L)PBG 7.60±0.88 9.02±0.73 31.16±4.28bc

2.2 干預后各組小鼠的相關指標

2.2.1 血清生化指標

與ND組比較，HFD組小鼠TC和FFA水平顯著增高(P<0.01)，與ND組和HFD組比較，與ND組和HFD組比較，DM小鼠FBG、FIns、TC、TG、FFA和HOMA-IR水平均顯著增高(P<0.05)。與DM組相比，DM＋V組的FBG、TC、TG和HOMA-IR顯著降低(P<0.05)。見表2。

表2 六組小鼠血清生化指標(±s，n＝5)Table 2 Serum biochemical parameters of mice in six groups

表2 六組小鼠血清生化指標(±s，n＝5)Table 2 Serum biochemical parameters of mice in six groups

注:與ND組相比，a P<0.05，b P<0.01；與HFD組相比，c P<0.01；與DM組相比，d P<0.05，e P<0.01。Note.Compared with ND group，a P<0.05，b P<0.01.Compared with HFD group，c P<0.01.Compared with DM group，d P<0.05，e P<0.01.

指標Index普食組ND group普食＋內脂素組ND＋V group高脂組HFD group高脂＋內脂素組HFD＋V group糖尿病組DM group糖尿病＋內脂素組DM＋V group空腹血糖(mmol/L)FBG 6.42±0.62 6.47±0.65 9.36±0.16 7.59±1.10 18.70±3.18ac 12.63±7.06d總膽固醇(mmol/L)TC 1.63±0.45 1.41±0.08 3.29±0.51b 3.20±0.36 7.19±0.47bc 4.78±0.63e甘油三酯(mmol/L)TG 0.62±0.29 0.52±0.13 0.40±0.13 0.40±0.25 2.31±0.30bc 1.65±0.31e游離脂肪酸(mmol/L)FFA 0.30±0.01 0.22±0.04 0.46±0.14b 0.36±0.02 0.69±0.08bc 0.61±0.02空腹胰島(mU/L)FIns 7.68±1.42 7.17±0.24 9.29±0.48 10.60±0.62 15.38±0.74bc 14.71±3.87胰島素抵抗指數HOMA-IR 2.16±0.18 2.06±0.13 3.87±0.15 3.56±0.36 12.78±2.24bc 7.47±1.95e

2.2.2 葡萄糖耐量實驗和胰島素耐量實驗

在GTT實驗中，注射葡萄糖后15 min時，ND組、ND＋V組、HFD組和HFD＋V組的血糖濃度均上升到最大值，之后開始下降直到180 min時血糖濃度恢復到注射前左右；而DM組小鼠在注射后90 min時血糖才達到峰值，之后開始下降；DM＋V組在t＝30 min時血糖升高到峰值，在t＝180 min血糖回歸到0點左右。與ND組比較，HFD組和DM組AUCGTT顯著增高(P<0.01或0.001)；與HFD組比較，DM組AUCGTT顯著增高(P<0.001)；與DM相比，DM＋V組AUCGTT顯著降低(P<0.01)。見圖1。

圖1 葡萄糖耐量實驗和曲線下面積Figure 1 Glucose tolerance test and area under curve

ITT實驗中，ND組、ND＋V組、HFD組、HFD＋V組和DM＋V組的血糖均在15~60 min時降至最低點，而DM組血糖先升高后下降，60 min時降至最低。分別與ND組和HFD組比較，DM組AUCITT均顯著增高(P<0.001)；和DM組相比，DM＋V組AUCITT顯著降低(P<0.01)。見圖2。

圖2 胰島素耐量實驗和曲線下面積Figure 2 Insulin tolerance test and area under curve

2.2.3 RT-qPCR檢測PI3K、Akt及FoxO1的mRNA表達

分別與ND組和HFD組比較，DM組PI3K、Akt的mRNA表達水平均顯著降低(P<0.001)，而FoxO1的mRNA表達水平均顯著增高(P<0.05)；與ND組相比，ND＋V組FoxO1的mRNA表達顯著降低(P<0.05)；與HFD組比較，ND組Akt的mRNA表達組顯著增高(P<0.05)；與DM組比較，DM＋V組PI3K及Akt的mRNA表達均顯著增高，FoxO1的mRNA表達顯著降低(P<0.01)。見表3。

表3 各組小鼠骨骼肌PI3K、Akt和FoxO1的mRNA表達(±s，n＝5)Table 3 Expressions level of PI3K，Akt and FoxO1 mRNA in skeletal muscle of mice among each group

表3 各組小鼠骨骼肌PI3K、Akt和FoxO1的mRNA表達(±s，n＝5)Table 3 Expressions level of PI3K，Akt and FoxO1 mRNA in skeletal muscle of mice among each group

注:與ND組相比，a P<0.05，b P<0.001；與HFD組相比，c P<0.05，d P<0.01，e P<0.001；與DM組相比，f P<0.01，h P<0.001。Note.Compared with ND group，a P<0.05，b P<0.001.Compared with HFD group，c P<0.05，d P<0.01，e P<0.001.Compared with DM group，f P<0.01，h P<0.001.

基因Genes普食組ND group普食＋內脂素組ND＋V group高脂組HFD group高脂＋內脂素組HFD＋V group糖尿病組DM group糖尿病＋內脂素組DM＋V group PI3K 1.00±0.05 1.09±0.05 0.85±0.09 0.95±0.15 0.48±0.11be 0.81±0.04f Akt 1.00±0.11 1.16±0.14 0.82±0.08a 0.92±0.07c 0.33±0.10be 0.75±0.05h FoxO1 0.53±0.14 0.32±0.16a 0.43±0.12 0.41±0.14 0.72±0.16ad 0.26±0.10h

2.2.4 Western blot法檢測PI3K/Akt信號通路及其下游相關分子的蛋白表達

與ND組比較，DM組PI3K110α、p-Akt蛋白表達水平顯著降低，FoxO1、p-FoxO1和PDK4的蛋白表達水平均顯著增高(P<0.05)；與ND組比較，HFD組FoxO1的蛋白表達顯著降低，而p-FoxO1的蛋白表達顯著增高(P<0.05)；ND＋V組FoxO1蛋白表達水平較ND組顯著降低(P<0.001)。與HFD組相比，DM組的p-Akt、p-FoxO1的蛋白表達水平均顯著降低，FoxO1、PDK4和PEPCK的蛋白表達水平均顯著增高(P<0.05)。與DM組比較，DM＋V組中PI3K110α、p-Akt及p-FoxO1的蛋白表達均顯著增高，而FoxO1、PDK4和PEPCK的蛋白表達水平均顯著降低(P<0.05)。見圖3~6。

圖3 各組小鼠骨骼肌組織PI3K和Akt的活性蛋白表達Figure 3 Active pntein expression of PI3K and Akt in skeletal muscle tissues of mice in each group

圖4 各組小鼠骨骼肌組織FoxO1的蛋白表達Figure 4 Protein expression of FoxO1 in skeletal muscle tissues of mice in each group

圖5 各組小鼠骨骼肌組織PDK4的蛋白表達Figure 5 Protein expression of PDK4 in skeletal muscle tissues of mice in each group

圖6 各組小鼠骨骼肌組織G6Pase和PEPCK的蛋白表達Figure 6 Protein expression of G6Pase and PEPCK in skeletal muscle tissues of mice in each group

3 討論

T2DM是一種多基因遺傳的慢性代謝紊亂綜合征，主要以糖脂代謝紊亂和胰島素作用受損、同時靶細胞或靶器官對胰島素刺激的反應能力減弱為特征[12－13]。近年來研究發現Visfatin可作用于胰島素受體，使胰島素受體底物酪氨酸磷酸化以激活下游PI3K/Akt等信號通路，具有與胰島素類似的功能[14]。前期研究也發現Visfatin可以通過PI3K/Akt信號途徑上調其下游糖原合成酶激酶3β和葡萄糖轉運體4的活性，下調FoxO1的表達，增加L6骨骼肌細胞和KKAy小鼠骨骼肌組織對葡萄糖的攝取，改善IR[7－8，15]，并且FoxO1與FBG、TG和HOMA-IR呈正性相關[16]。

骨骼肌是調節糖脂代謝的關鍵外周組織，Visfatin還可影響骨骼肌的胰島素敏感性，維持葡萄糖穩態[4]。臨床研究表明Visfatin血漿濃度與人體內臟脂肪量密切相關，在肥胖和T2DM人群中Visfatin濃度明顯升高，提示其可能參與肥胖相關的IR和糖尿病的發生[17]。FoxO1是能量穩態的關鍵轉錄因子，能直接上調骨骼肌組織PDK4的表達，減少葡萄糖的利用[18－19]，本實驗中KKAy糖尿病小鼠的體重、攝食和血糖顯著增高，出現典型的糖代謝紊亂特征[20]，分別與ND組和HFD組比較，DM組FBG、TC、TG、FFA、FIns、AUCGTT、AUCITT及HOMA-IR水平均顯著增高，HFD組小鼠TC和FFA水平較ND組均顯著增高，而注射Visfatin重組蛋白后，DM＋V組的FBG、TC、TG、HOMA-IR、AUCGTT和AUCITT水平顯著降低，提示Visfatin可改善糖尿病小鼠的胰島素敏感性及糖脂代謝。糖尿病小鼠骨骼肌PI3K、Akt的基因及蛋白活性表達較ND和HFD組顯著降低，而FoxO1及PDK4的基因和蛋白表達水平較ND組和HFD組均明顯增高；注射內脂素后DM組骨骼肌PI3K、Akt的基因和蛋白活性表達均顯著增高，而FoxO1及PDK4基因和蛋白表達水平均顯著降低。本實驗證實Visfatin下調了骨骼肌FoxO1和PDK4的表達，但HFD組及DM＋V組FoxO1與p-FoxO1蛋白水平表達結果不一致，我們推測:(1)FoxO1不僅由磷酸化修飾，可能還與泛素化及乙酰化等其他蛋白翻譯后修飾作用有關，從而影響FoxO1的表達；(2)FoxO1包含三個由Akt控制的磷酸化位點，即Thr24、Ser256和Ser319，而本實驗中只檢測了FoxO1蛋白磷酸化位點其中之一，不能完全代表p-FoxO1蛋白水平的表達。

FoxO1可誘導其下游靶點PDK4的轉錄激活，同時，PDK4可使丙酮酸脫氫酶復合物磷酸化失活，減少丙酮酸進入三羧酸循環，從而調節糖異生和糖酵解途徑，而葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)和磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)是催化糖異生的關鍵酶[19，21]。研究發現通過誘導PDK基因，過氧化物酶體增殖物激活受體γ激活因子1α將促進丙酮酸代謝為乙酰輔酶A，進入糖異生途徑；相反，抑制PDK4基因后，可降低血糖、改善IR[22]。在肥胖小鼠和IR的肝細胞中PEPCK和G6Pase表達明顯增加，而抑制PEPCK和G6Pase的表達可通過減少肝糖異生從而逆轉IR[23－24]。本實驗中DM＋V組小鼠骨骼肌中PEPCK蛋白表達明顯低于DM組小鼠，與上述研究結果一致，但G6Pase蛋白表達無明顯差異，可能是實驗中注射Visfatin的時間較短所致。因此，進一步構建Visfatin過表達腺相關病毒載體，擬研究長時間持續作用的Visfatin對糖脂代謝相關分子基因和蛋白表達的影響，有待于更進一步證實Visfatin在糖尿病及IR中的作用。

總之，在KKAy糖尿病小鼠骨骼肌組織中，Visfatin可能通過PI3K/Akt途徑下調FoxO1、PDK4的表達，發揮改善糖脂代謝和IR的作用。本研究也存在一定的局限性，后續將繼續完成過表達腺相關病毒實驗，同時用腺相關病毒干擾PI3K/Akt/FoxO1信號通路后觀察FoxO1及其下游分子的表達變化，以期為糖尿病和IR防治提供潛在的視點。