冬凌草甲素通過調控UBC9表達對肝星狀細胞增殖、凋亡的影響

梁會娟任志芳劉 偉張彥忠

(1.新鄉醫學院第三附屬醫院臨床藥學辦公室，河南 新鄉 453003；2.濮陽醫學高等專科學校，河南 濮陽 457000；3.新鄉醫學院第三附屬醫院，河南 新鄉 453003)

肝纖維化(hepatic fibrosis，HF)是一種常見的慢性肝損傷的傷口愈合反應，是慢性肝病最終發展為肝硬化或肝細胞癌的重要病理過程。肝星狀細胞(hepatic stellate cells，HSC)是肝纖維化的關鍵細胞，正常肝中HSC處于靜止狀態，當肝受到異常刺激時，HSC活化、增殖并分泌大量細胞外基質(extracellular matrix，ECM)，導致肝ECM合成和降解失衡，促進HF形成[1]。因此，如何有效的抑制HSC增殖，誘導其凋亡是防治HF的重要措施。冬凌草甲素是從冬凌草中分離得到的二萜類化合物，具有抗炎、抗癌、神經保護等多種生物學功能[2－3]。有文獻報道冬凌草甲素可誘導HSC凋亡和周期阻滯，抑制內源性和轉化生長因子β1(transforming growth factorβ1，TGF-β1)誘導的ECM合成，是一種潛在的預防HF藥物[4]。然而，冬凌草甲素抗HF的潛在分子機制并未完全闡明。泛素結合酶9(ubiquitin Conjugating Enzyme 9，UBC9)是小泛素樣分子相關修飾物(small ubiquitin-like molecular related modifiers，SUMO)泛素化過程的唯一接合酶，研究顯示UBC9參與HSC凋亡過程，下調UBC9可抑制HF進程[5]。但冬凌草甲素能否調控UBC9影響HF進程尚未可知。本研究以UBC9為切入點，探討冬凌草甲素對大鼠肝星狀細胞HSC-T6增殖、凋亡的影響和分子機制，以期為冬凌草甲素用于臨床防治HF提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 細胞

大鼠肝星狀細胞HSC-T6購于美國模式生物保藏中心。

1.2 主要試劑與儀器

杜爾伯格伊戈爾培養基(dulbecco’s modified eagle medium，DMEM)、胎牛血清購于美國Gibco公司；冬凌草甲素(批號111721-201704，純度≥99.7%)購于中國食品藥品檢定研究院；UBC9小干擾RNA(UBC9 small interfering RNA，si-UBC9)及其陰性對照(small interfering RNA nagative control，si-NC)、UBC9過表達載體(UBC9 overexpression vector， pcDNA-UBC9)、空載體(Empty vector plasmid，pcDNA)由上海吉瑪制藥公司提供；凋亡試劑盒、噻唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)試劑盒購于上海碧云天公司；山羊抗兔二抗、兔源UBC9抗體、細胞周期素D1(CyclinD1)、p21、B細胞淋巴瘤-2(B cell lymphoma-2，Bcl-2)和Bcl相關X蛋白(Bcl associated x protein，Bax)抗體購于上海賽信通生物技術公司；逆轉錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒購于大連TaKaRa生化科技公司；TRIzol試劑、LipofectamineTM2000購于美國Invitrogen公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養和實驗分組

復蘇HSC-T6細胞后，用含1%青鏈霉素雙抗、10%胎牛血清的DMEM培養液，置于37℃、CO2體積分數5%、濕度為70%~80%的培養箱中培養。每隔1 d換液1次，當細胞密度到80%時，即可進行傳代培養。分別采用冬凌草甲素濃度為10、20、40μmol/L的細胞培養液培養HSC-T6細胞48 h，依次記為冬凌草甲素-低組、冬凌草甲素-中組、冬凌草甲素-高組[6]。同時設置對照組即正常培養的HSCT6細胞。按照下述方法檢測HSC-T6細胞增殖、凋亡、增殖凋亡相關蛋白、UBC9的表達水平。

為證實冬凌草甲素對肝星狀細胞增殖、凋亡的影響與調控UBC9表達有關，將HSC-T6細胞分為si-NC組(轉染si-NC)、si-UBC9組(轉染si-UBC9)、冬凌草甲素＋pcDNA組(轉染pcDNA后用含40 μmol/L冬凌草甲素的細胞培養液孵育48 h)、冬凌草甲素＋pcDNA-UBC9組(轉染pcDNA-UBC9后用含40μmol/L冬凌草甲素的細胞培養液孵育48 h)。細胞轉染參照LipofectamineTM2000說明書進行。

1.3.2 MTT實驗檢測細胞增殖

取5×103個對數期HSC-T6細胞接種96孔板，當細胞貼壁后，按照上述實驗分組進行干預處理后，加入20μL MTT試劑，反應4 h，吸取孔內培養液，再加入150μL二甲基亞砜，低速振蕩10 min，當結晶溶解后用酶標儀測定各孔在450 nm處的吸光度(absorbance，A)值。細胞增殖抑制率＝[(A對照孔－A實驗孔)/(A對照孔－A空白孔)]×100%

1.3.3 流式細胞術檢測細胞凋亡

用適量結合緩沖液重懸各組HSC-76細胞，向500μL細胞懸液中添加5μL的Annexin V-FITC、5 μL的PI溶液，混合均勻后，室溫避光條件下反應15 min，上機檢測細胞凋亡率。

1.3.4 蛋白質印記(Western blot)檢測蛋白表達水平

使用RIPA裂解液對各組HSC-T6細胞進行裂解。制備十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠。將蛋白樣品與適量上樣緩沖液混勻，沸水浴加熱3 min變性蛋白。取30μg蛋白樣品上樣后100 V電泳90 min分離蛋白樣品，濕法轉膜至硝酸纖維素膜后，置于5%脫脂牛奶中4℃封閉過夜。置于稀釋的一抗溶液中室溫反應2 h；置于二抗稀釋液中孵育1 h。顯影后用凝膠成像系統分析目的蛋白(內參為GAPDH)的相對表達水平。

1.3.5 實時熒光定量PCR(Real-time quantitative PCR，RT-qPCR)檢測UBC9 mRNA表達水平

TRIzol試劑提取各組HSC-76細胞總RNA，以逆轉合成的cDNA為模板進行qPCR擴增。95℃預變性10 min；95℃變性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個循環。2－ΔΔCt法分析UBC9 mRNA相對表達水平。引物序列(5’-3’):UBC9上游GGAAGTCCCGAGACAAAGGG，下游CAGCCACGAA ACCAAATGGG，GAPDH上游TGGACCAAGTACAT GAACCACC，下游CTGGTGATTGGACACGGTGA。

1.4 統計學分析

采用SPSS 20.0進行統計學分析。實驗獨立重復3次，計量資料符合正態分布以平均數±標準差(±s)表示。兩組間統計分析采用獨立樣本t檢驗，多組間統計分析采用單因素方差分析和SNK-q檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 冬凌草甲素對大鼠肝星狀細胞HSC-T6增殖的影響

與對照組比較，冬凌草甲素-低、-中、-高劑量組HSC-T6細胞CyclinD1蛋白表達顯著降低，細胞抑制率、p21蛋白表達顯著升高(P<0.05)，且冬凌草甲素對HSC-T6細胞增殖和相關蛋白表達的影響具有劑量依賴性。見表1和圖1。

表1 冬凌草甲素對大鼠肝星狀細胞HSC-T6增殖的影響(±s，n＝3)Table 1 Effect of Oridonin on the proliferation of rat hepatic stellate cells HSC-T6

表1 冬凌草甲素對大鼠肝星狀細胞HSC-T6增殖的影響(±s，n＝3)Table 1 Effect of Oridonin on the proliferation of rat hepatic stellate cells HSC-T6

注:與對照組相比，*P<0.05；與冬凌草甲素-低組相比，＃P<0.05；與冬凌草甲素-中組相比，＆P<0.05。Note.Compared with the control group，*P<0.05.Compared with the Oridonin-low group，＃P<0.05.Compared with the Oridonin-medium group，＆P<0.05.

分組Groups抑制率(%)Inhibition ratio CyclinD1 CyclinD1 p對照組Control group 0.00±0.03 0.64±0.冬凌草甲素-低組Oridonin-low group 11.25±1.17* 0.52±0.冬凌草甲素-中組Oridonin-medium group 28.36±2.74*＃ 0.39±0.冬凌草甲素-高組Oridonin-high group 49.68±4.33*＃＆ 0.24±0.203.542 41.244 F蛋白rotein p21蛋白p21 protein 06 0.20±0.02 05* 0.33±0.03*04*＃ 0.46±0.04*＃03*＃＆0.59±0.05*＃＆ 62.593 P 0.000 0.000 0.000?

圖1 增殖相關蛋白表達Figure 1 Expression of proliferation-related proteins

2.2 冬凌草甲素對大鼠肝星狀細胞HSC-T6凋亡的影響

與對照組比較，冬凌草甲素-低、-中、-高劑量組HSC-T6細胞Bcl-2蛋白表達顯著降低，Bax蛋白表達、凋亡率顯著升高(P<0.05)，且冬凌草甲素對HSC－T6細胞凋亡和相關蛋白表達的影響具有劑量依賴性。見表2和圖2。

圖2 冬凌草甲素對大鼠肝星狀細胞HSC-T6凋亡的影響Figure 2 Effect of Oridonin on the apoptosis of rat hepatic stellate cells HSC-T6

表2 冬凌草甲素對大鼠肝星狀細胞HSC-T6凋亡的影響(±s，n＝3)Table 2 Effect of Oridonin on the apoptosis of rat hepatic stellate cells HSC-T6

表2 冬凌草甲素對大鼠肝星狀細胞HSC-T6凋亡的影響(±s，n＝3)Table 2 Effect of Oridonin on the apoptosis of rat hepatic stellate cells HSC-T6

注:與對照組相比，*P<0.05；與冬凌草甲素-低組組相比，＃P<0.05；與冬凌草甲素-中組組相比，＆P<0.05。Note.Compared with the control group，*P<0.05.Compared with the Oridonin-low group，＃P<0.05.Compared with the Oridonin-medium group，＆P<0.05.

分組Groups凋亡率(%)Apoptosis rate Bcl-2蛋白Bcl-2 protein Bax蛋白Bax protein對照組Control group 7.32±0.71 0.77±0.07 0.29±0.03冬凌草甲素-低組Oridonin-low group 11.65±1.23* 0.64±0.06* 0.44±0.04*冬凌草甲素-中組Oridonin-medium group 17.32±1.65*＃ 0.52±0.04*＃ 0.56±0.05*＃冬凌草甲素-高組Oridonin-high group 22.14±2.19*＃＆ 0.36±0.03*＃＆ 0.68±0.06*＃＆52.834 33.264 38.826 P 0.000 0.000 0.000 F

2.3 冬凌草甲素對大鼠肝星狀細胞HSC-T6中UBC9表達的影響

與對照組比較，冬凌草甲素-低、-中、-高劑量組HSC-T6細胞UBC9 mRNA和UBC9蛋白表達顯著降低(P<0.05)，冬凌草甲素對UBC9 mRNA和UBC9蛋白表達的影響具有依賴性。見表3和圖3。

圖3 UBC9蛋白表達Figure 3 Expression of UBC9 protein

表3 冬凌草甲素對大鼠肝星狀細胞HSC-T6中UBC9表達的影響(±s，n＝3)Table 3 Effects of Oridonin on UBC9 expression in rat hepatic stellate cells HSC-T6

表3 冬凌草甲素對大鼠肝星狀細胞HSC-T6中UBC9表達的影響(±s，n＝3)Table 3 Effects of Oridonin on UBC9 expression in rat hepatic stellate cells HSC-T6

注:與對照組相比，*P<0.05；與冬凌草甲素-低組組相比，＃P<0.05；與冬凌草甲素-中組組相比，＆P<0.05。Note.Compared with the control group，*P<0.05.Compared with the Oridonin-low group，＃P<0.05.Compared with the Oridonin-medium group，＆P<0.05.

分組Groups UBC9 mRNA UBC9蛋白UBC9 protein對照組Control group 1.00±0.05 0.84±0.08冬凌草甲素-低組Oridonin-low group 0.75±0.07* 0.71±0.06*冬凌草甲素-中組Oridonin-medium group 0.63±0.06*＃ 0.56±0.04*＃冬凌草甲素-高組Oridonin-high group 0.49±0.04*＃＆ 0.41±0.03*＃＆F 44.532 33.216 P 0.000 0.000

2.4 干擾UBC9表達對大鼠肝星狀細胞HSC-T6增殖的影響

與si-NC組比較，si-UBC9組HSC-T6細胞UBC9蛋白表達顯著降低，表明HSC-T6細胞中UBC9表達受到抑制。抑制UBC9表達后，HSC-T6細胞CyclinD1蛋白表達顯著降低，增殖抑制率、p21蛋白表達顯著升高(P<0.05)。見表4和圖4。

表4 干擾UBC9表達對大鼠肝星狀細胞HSC-T6增殖的影響(±s，n＝3)Table 4 Effects of inference with UBC9 expression on proliferation of rat hepatic stellate cells HSC-T6

表4 干擾UBC9表達對大鼠肝星狀細胞HSC-T6增殖的影響(±s，n＝3)Table 4 Effects of inference with UBC9 expression on proliferation of rat hepatic stellate cells HSC-T6

注:與si-NC組相比，*P<0.05。Note.Compared with si-NC group，*P<0.05.

分組Groups UBC9蛋白UBC9 protein抑制率(%)Inhibition ratio CyclinD1蛋白CyclinD1 protein p21蛋白p21 protein陰性對照si-NC 0.83±0.07 6.33±0.61 0.62±0.06 0.22±0.02干擾UBC9表達組si-UBC9 0.39±0.04* 41.58±4.22* 0.28±0.03* 0.55±0.05*t 9.453 14.319 8.779 10.614 P 0.001 0.000 0.001 0.000

圖4 UBC9和增殖相關蛋白表達Figure 4 Expression of UBC9 protein

2.5 干擾UBC9表達對大鼠肝星狀細胞HSC-T6凋亡的影響

抑制UBC9表達后，HSC-T6細胞Bcl-2蛋白表達降低，凋亡率、Bax蛋白表達顯著升高(P<0.05)。見表5和圖5。

表5 干擾UBC9表達對大鼠肝星狀細胞HSC-T6凋亡的影響(±s，n＝3)Table 5 Effects of interference with UBC9 expression on the apoptosis of rat hepatic stellate cells HSC-T6

表5 干擾UBC9表達對大鼠肝星狀細胞HSC-T6凋亡的影響(±s，n＝3)Table 5 Effects of interference with UBC9 expression on the apoptosis of rat hepatic stellate cells HSC-T6

注:與si-NC組相比，*P<0.05。Note.Compared with si-NC group，*P<0.05.

圖5 干擾UBC9表達對大鼠肝星狀細胞HSC-T6凋亡的影響Figure 5 Effects of interference with UBC9 expression on the apoptosis of rat hepatic stellate cells HSC-T6

2.6 過表達UBC9逆轉冬凌草甲素(40μmol/L)對大鼠肝星狀細胞HSC-T6增殖和凋亡的作用

與對照組比較，冬凌草甲素組HSC-T6細胞CyclinD1、Bcl-2和UBC9蛋白表達顯著降低，p21和Bax蛋白表達、增殖抑制率、凋亡率顯著升高；與冬凌草甲素＋pcDNA組比較，冬凌草甲素＋pcDNAUBC9組HSC-T6細胞CyclinD1、Bcl-2和UBC9蛋白表達顯著升高，p21和Bax蛋白表達、增殖抑制率、凋亡率顯著降低(P<0.05)。見表6和圖6。

表6 UBC9過表達逆轉了冬凌草甲素對大鼠肝星狀細胞HSC-T6增殖和凋亡的作用(±s，n＝3)Table 6 UBC9 overexpression reversed the effect of Rubescensine A on the proliferation and apoptosis of rat hepatic stellate cells HSC-T6

表6 UBC9過表達逆轉了冬凌草甲素對大鼠肝星狀細胞HSC-T6增殖和凋亡的作用(±s，n＝3)Table 6 UBC9 overexpression reversed the effect of Rubescensine A on the proliferation and apoptosis of rat hepatic stellate cells HSC-T6

注:與對照組相比，*P<0.05；與冬凌草甲素＋pcDNA組相比，＃P<0.05。Note.Compared with the control group，*P<0.05.Compared with the Oridonin＋pcDNA group，＃P<0.05.

分組Groups UBC9蛋白UBC9 protein抑制率(%)Inhibition ratio凋亡率(%)Apoptosis rate CyclinD1蛋白CyclinD1 protein p21蛋白p21 protein Bcl-2蛋白Bcl-2 protein Bax蛋白Bax protein對照組Control group 0.82±0.07 0.00±0.02 6.32±0.63 0.63±0.06 0.21±0.02 0.78±0.07 0.27±0.03冬凌草甲素Oridonin 0.41±0.04* 47.21±4.33* 21.62±2.13* 0.23±0.03* 0.57±0.05* 0.35±0.03* 0.67±0.06*冬凌草甲素＋pcDNA Oridonin＋pcDNA 0.38±0.03 48.65±4.72 23.58±2.36 0.22±0.02 0.58±0.06 0.34±0.03 0.69±0.07冬凌草甲素＋pcDNA-UBC9 Oridonin＋pcDNA-UBC9 0.71±0.07＃ 20.11±2.03＃ 11.28±1.14＃ 0.52±0.05＃ 0.33±0.03＃ 0.67±0.06＃ 0.39±0.04＃F 46.634 145.099 69.359 69.514 54.203 58.447 47.236 P 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

圖6 UBC9過表達逆轉了冬凌草甲素對大鼠肝星狀細胞HSC-T6增殖和凋亡的作用Figure 6 UBC9 overexpression reversed the effect of Rubescensine A on the proliferation and apoptosis of rat hepatic stellate cells HSC-T6

3 討論

冬凌草甲素是東亞地區常用中草藥冬凌草的天然活性成分，近年來因其廣泛的生物活性和治療多種疾病的潛力而受到越來越多的關注。研究顯示，冬凌草甲素通過調節相關信號通路抑制細胞增殖、觸發自噬、誘導凋亡、阻滯細胞周期進展等機制對肝癌[7]、膽管癌[8]、神經母細胞瘤[9]等多種類型惡性腫瘤表現出抗腫瘤作用，是潛在的癌癥候選治療藥物。冬凌草甲素還可抑制博萊霉素誘導的小鼠肺組織中平滑肌肌動蛋白和I型膠原蛋白表達，減輕肺泡空間塌陷、肺氣腫和炎癥細胞浸潤，防治肺纖維化病變[10]。此外，冬凌草甲素還可通過促進P21相關的自噬來預防心肌肥大[11]。本研究探討冬凌草甲素的抗HF作用發現，冬凌草甲素可顯著抑制HSC-T6細胞增殖，誘導細胞凋亡，并呈顯著的量效依賴關系，與Bohanon等[4]研究結果相吻合。CyclinD1和P21細胞增殖過程中的關鍵調控蛋白，P21通過抑制周期素依賴激酶(cyclin dependent kinases，CDKs)/CyclinD1復合物活性，抑制G1-S期相變發揮抗增殖作用[12]。Bcl-2和Bax是細胞凋亡調控中重要的蛋白，Bax表達增加、Bcl-2表達降低可促進線粒體膜通透性改變，抑制孔道開放以及抑制細胞色素C從線粒體釋放，抑制Caspases活化進而抑制細胞凋亡發生[13]。本研究顯示，冬凌草甲素呈劑量依賴性抑制CyclinD1、Bcl-2表達，促進P21、Bax表達，這提示冬凌草甲素可能通過調控CyclinD1、P21、Bax、Bcl-2蛋白抑制HSC-T6增殖并誘導其凋亡。

UBC9是UBC家族的重要成員，其通過促使活化的SUMO與目標蛋白接合，進而介導SUMO發揮蛋白調節作用，是纖維化的關鍵調節因子[14]。研究顯示，在腎臟纖維化過程中UBC9表達上調[15]。沉默UBC9通過抑制早幼粒細胞白血病蛋白類泛素化可降低主動脈縮窄小鼠心肌纖維化的發展，并部分改善其心功能[16]。在活化的人HSC細胞LX-2中UBC9表達顯著上調，沉默UBC9可明顯抑制HSC增殖，降低平滑肌肌動蛋白和Ⅰ型膠原的表達水平，進而阻止HF[17]。此外，多種肝癌細胞中UBC9亦呈高表達，干擾UBC9表達可明顯降低肝癌細胞的增殖、遷移能力，提高其凋亡水平[18－19]。為探討UBC9在冬凌草甲素抗HF中的作用，本研究檢測冬凌草甲素干預后HSC-T6細胞中UBC9表達水平，結果顯示冬凌草甲素呈劑量依賴性抑制UBC9表達水平，提示UBC9表達下調可能與冬凌草甲素的抗HF作用有關。進一步研究顯示，轉染si-UBC9干擾UBC9表達對HSC-T6細胞亦具有顯著的增殖抑制和凋亡作用。此外，本研究顯示過表達還能夠逆轉冬凌草甲素對HSC-T6細胞的增殖、凋亡以及其相關蛋白表達的影響，提示冬凌草甲素對HSC-T6細胞的增殖抑制和凋亡促進作用抑制UBC9表達有關。

綜上所述，冬凌草甲素可抑制HSC-T6細胞增殖，促進細胞凋亡，進而具有預防HF的潛在價值，其機制與抑制UBC9表達有關，這為開發冬凌草甲素用于臨床防治HF奠定了理論基礎。