VEGF抑制劑對糖尿病性視網膜病變模型大鼠的干預效果及對CRA血流動力學的影響

侯立亭郭 洋胡紅霞

(開封市中心醫院眼科，河南 開封 475000)

糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy，DR)是一種糖尿病微血管并發癥，是一種特異性眼底病變，其主要的病理改變為視網膜微血管變化[1]。DR患者的發病率主要與糖尿病病程相關，患者常出現的臨床癥狀主要有硬性滲出、IRMA、出血斑點、微動脈瘤等，缺血廣泛可降低患者視力，致視網膜脫離，嚴重情況下可致盲[2]。DR的發生機制尚未完全明確，較為復雜，目前相關研究主要表明其與高血糖引起的代謝紊亂有關，包括蛋白質非酶糖基化終末產物的形成和己糖胺途徑的激活。蛋白激酶C激活，造成血管功能紊亂及氧化應激炎癥反應，導致血管閉塞、局部缺血及血管滲透性增強[3－4]。VEGF抑制劑可阻止脈絡膜新生血管形成，解除視網膜水腫，防治血管成分滲漏，改善視力，貝伐單抗屬于一種典型的VEGF抑制劑，在治療多種晚期腫瘤中效果明顯，目前已經有研究顯示通過玻璃體注射貝伐單抗，能治療眼部新生血管性疾病，但是患者會出現并發癥，其作用機制也尚不明確[5]。本文將研究VEGF抑制劑對糖尿病性視網膜病變模型大鼠的干預效果及對CRA血流動力學的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

選取40只SPF級、健康雄性大鼠，4~6周齡，平均年齡(4.8±0.9)周，體重為170~190 g，平均體重(171.0±9.5)g，由廣東斯嘉景達生物科技有限公司提供[SCXK(粵)2020-0052]，經開封市中心醫院倫理委員會審批批準(IACUC-201805-K1)。實驗開始前，所有大鼠在我院動物研究實驗中心[SYXK(粵)2021-0251]適應性飼養1周，自由飲水，12 h晝夜節律，溫度為20~25℃，濕度為40%~50%。

1.2 主要試劑與儀器

貝伐單抗(上海麥克林生化科技有限公司，貨號:B873505-1)；無菌檸檬酸(中國藥品生物制品檢定所，批號:2003-10)；LBY-HJ四通道血小板聚集儀(上海寰熙醫療器械有限公司，貨號:79028)；Laser Doppler Flowmetry激光血流儀(瑞典perimed，型號:P457)；血糖儀(美國強生)；雙抗體夾人酶聯免疫法試劑盒(上海西唐生物公司，貨號:F26260)。

1.3 實驗方法

1.3.1 糖尿病性視網膜病變大鼠模型建立

對照組大鼠10只給予標準飼料喂養，模型組、無菌檸檬酸組、VEGF抑制劑組各10只大鼠給予高脂飼料喂養。在8周后，對照組給予生理鹽水，模型組、無菌檸檬酸組、VEGF抑制劑組大鼠給予腹腔注射40 mg/kg鏈脲佐菌素。3 d后尿糖3＋，采集大鼠尾靜脈血測血糖，血糖≥16.7 mmol/L，糖尿病大鼠造模成功。各組大鼠飲食情況如前，繼續喂養4周后，行眼底血管熒光造影檢查，確立大鼠出現糖尿病視網膜病變，建模成功。

1.3.2 干預

無菌檸檬酸組給予0.05 mL的無菌檸檬酸腹腔干預；VEGF抑制劑組大鼠給予玻璃體腔內注入0.05 mL貝伐單抗干預；對照組、模型組給予等體積的生理鹽水干預，四組均連續給藥每天1次，各組均連續干預2周。

1.3.3 CRA血流參數檢測

應用飛利浦IU22型彩色多普勒檢查，探頭頻率:10 MHz。腹腔注射麻醉，在獲取連續5個以上穩定心動周期時，檢測干預2周后大鼠右眼CRA各項血流參數。根據多普勒超聲血流指標測定峰值血流速度:EDV、PSV、RI及PI。重復上述操作3次，取各項指標的平均值。

1.3.4 血液流變學指標檢測

采用激光血流儀檢測大鼠干預2周后全血粘度。大鼠心腔采血2.5 mL，血小板聚集率檢測用四通道血小板聚集儀。大鼠心腔采血1.5 mL，血小板黏附率檢測用體外血栓形成、血小板黏附兩用儀。

1.3.5 脂聯素、空腹血糖(FBG)、細胞間黏附分子-1(ICAM-1)、白介素-1β(IL-1β)水平檢測

血糖測試前對動物禁食12 h，使用血糖儀檢測FBG水平。抽取大鼠尾部靜脈血2 mL，采用PBS緩沖液進行洗滌處理，轉速為2000 r/min離心干預10 min，摒棄上清液，采用雙抗體夾心酶聯免疫法試劑盒檢測各組大鼠血漿中脂聯素、ICAM-1、IL-1β水平。

1.3.6 病理學觀察

采用LDF激光血流儀及眼球固定象限測定法檢測干預2周后各組大鼠雙眼血流。檢查完成后將大鼠處死，摘取每只大鼠左側眼球，10%甲醛固定24 h，經脫鈣、脫水、透明以及包埋等處理制成石蠟塊，保存待用。將組織進行切片，HE染色，光鏡下觀察病理學變化。

1.3.7 Western blot檢測Ras、Raf-1及ERK表達量檢測

將所采集到的大鼠左側眼球組織標本，進行研磨，然后加入蛋白緩沖液，常規蛋白提取，BCA法定量分析。50μg蛋白樣品上樣后SDS-PAGE電泳，電轉到PVDF膜，在TBST中將5%的脫脂奶粉避光封閉1 h，洗滌后加入一抗稀釋溶液(Ras、Raf-1及ERK按照1∶1000比例進行稀釋)，在4℃的環境中保存過夜，洗滌后加入二抗稀釋溶液(Ras、Raf-1及ERK按照1∶5000比例進行稀釋)，在溫床中孵育1 h后再次洗滌，加入發光液ECL，使軟件分析蛋白條帶灰度值，內參蛋白是GAPDH。

1.4 統計學方法

采用SPSS 19.0統計軟件包進行統計分析處理。計量資料采用平均數±標準差(±s)描述，多組間比較采用齊性方差檢驗，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，P<0.05具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠CRA血流參數比較

如表1所示，與正常大鼠相比，模型組、無菌檸檬酸組、VEGF抑制劑組EDV、PSV水平降低，RI及PI水平升高，具有顯著性差異(P<0.05)；與模型組相比，無菌檸檬酸組、VEGF抑制劑組EDV、PSV水平升高，RI及PI水平降低，具有顯著性差異(P<0.05)；與無菌檸檬酸組相比，VEGF抑制劑組EDV、PSV水平升高，RI及PI水平降低，具有顯著性差異(P<0.05)。

表1 各組大鼠CRA血流參數比較(±s，n＝10)Table 1 Comparison of CRA blood flow parameters of rats in each group

表1 各組大鼠CRA血流參數比較(±s，n＝10)Table 1 Comparison of CRA blood flow parameters of rats in each group

注:與對照組相比，a P<0.05；與模型組相比，b P<0.05；與無菌檸檬酸組相比，c P<0.05。Note.Compared with the control group，a P<0.05.Compared with the model group，b P<0.05.Compared with the sterile citric acid group，c P<0.05.

組別Groups 舒張期最低流速(mm/s)EDV 收縮期峰值血流速度(mm/s)PSV 阻力指數RI 搏動指數PI對照組Control group 108.12±20.25 178.83±25.14 0.41±0.11 0.50±0.13模型組Model group 31.53±8.42a 58.92±11.37a 1.12±0.32a 1.35±0.35a無菌檸檬酸組Sterile citric acid group 47.46±10.29ab 84.16±14.52ab 0.85±0.20ab 0.91±0.22ab VEGF抑制劑組VEGF inhibitor group 90.26±16.55abc 155.57±18.67abc 0.68±0.10abc 0.69±0.12abc F 16.566 20.614 9.953 10.799 P 0.001 0.001 0.001 0.001

2.2 病理學觀察

如圖1所示，對照組大鼠細胞內外節形態規整，視網膜各層細胞排列整齊。模型組大鼠視網膜內血管擴張，視網膜各層細胞結構排列紊亂，細胞間水腫。無菌檸檬酸組大鼠周細胞輕度水腫，各層細胞結構排列紊亂。VEGF抑制劑組視網膜各層細胞排列較完整。

圖1 大鼠視網膜組織病理學觀察(HE染色)Figure 1 Histopathological observation of retina in rats(HE staining)

2.3 各組大鼠血液流變學指標比較

如表2所示，與正常大鼠相比，模型組、無菌檸檬酸組、VEGF抑制劑組全血粘度、血小板聚集率及血小板黏附率水平升高，具有顯著性差異(P<0.05)；與模型組相比，無菌檸檬酸組、VEGF抑制劑組全血粘度、血小板聚集率及血小板黏附率水平降低，具有顯著性差異(P<0.05)；與無菌檸檬酸組相比，VEGF抑制劑組全血粘度、血小板聚集率及血小板黏附率水平降低，具有顯著性差異(P<0.05)。

表2 各組大鼠血液流變學指標比較(±s，n＝10)Table 2 Comparison of hemorheological indexes of rats in each group

表2 各組大鼠血液流變學指標比較(±s，n＝10)Table 2 Comparison of hemorheological indexes of rats in each group

注:與對照組相比，a P<0.05；與模型組相比，b P<0.05；與無菌檸檬酸組相比，c P<0.05。Note.Compared with the control group，a P<0.05.Compared with the model group，b P<0.05.Compared with the sterile citric acid group，c P<0.05.

組別Groups全血粘度(mPa/s)Whole blood viscosity血小板聚集(%)Platelet aggregation rate血小板黏附(%)Platelet adhesion rate對照組Control group 1.13±40.22 58.65±13.92 26.31±5.20模型組Model group 1.96±0.63a 85.24±19.76a 48.73±12.82a無菌檸檬酸組terile citric acid group 1.75±0.45ab 76.31±17.53ab 39.18±10.35a VEGF抑制劑組VEGF inhibitor group 1.40±0.35abc 62.18±15.10abc 33.30±8.22ab 3.109 4.902 4.178 P 0.001 0.001 0.001 F Sbc

2.4 各組大鼠脂聯素、空腹血糖水平比較

如表3所示，與正常大鼠相比，模型組、無菌檸檬酸組、VEGF抑制劑組脂聯素水平降低，FBG水平升高，具有顯著性差異(P<0.05)；與模型組相比，無菌檸檬酸組、VEGF抑制劑組脂聯素水平升高，FBG水平降低，具有顯著性差異(P<0.05)；與無菌檸檬酸組相比，VEGF抑制劑組脂聯素水平升高，FBG水平降低，具有顯著性差異(P<0.05)。

表3 各組大鼠脂聯素、FBG水平比較(±s，n＝10)Table 3 Comparison of adiponectin and FBG levels of rats in each group

表3 各組大鼠脂聯素、FBG水平比較(±s，n＝10)Table 3 Comparison of adiponectin and FBG levels of rats in each group

注:與對照組相比，a P<0.05；與模型組相比，b P<0.05；與無菌檸檬酸組相比，c P<0.05。Note.Compared with the control group，a P<0.05.Compared with the model group，b P<0.05.Compared with the sterile citric acid group，c P<0.05.

組別Groups脂聯素(mg/L)Adiponectin空腹血糖(mmol/L)FBG對照組Control group 2.29±0.71 5.35±1.18模型組Model group 0.31±0.10a 17.48±3.08a無菌檸檬酸組Sterile citric acid group 0.58±0.25ab 12.51±2.61ab VEGF抑制劑組VEGF inhibitor group 1.65±0.55abc 8.91±1.70abc 11.726 17.445 P 0.001 0.001 F

2.5 各組大鼠VEGF、ICAM-1及IL-1β水平比較

如表4所示，與正常大鼠相比，模型組、無菌檸檬酸組、VEGF抑制劑組VEGF、ICAM-1及IL-1β水平升高，具有顯著性差異(P<0.05)；與模型組相比，無菌檸檬酸組、VEGF抑制劑組VEGF、ICAM-1及IL-1β水平降低，具有顯著性差異(P<0.05)；與無菌檸檬酸組相比，VEGF抑制劑組VEGF、ICAM-1及IL-1β水平降低，具有顯著性差異(P<0.05)。

表4 各組大鼠VEGF、ICAM-1及IL-1β水平比較(±s，n＝10)Table 4 Comparison of VEGF，ICAM-1 and IL-1β levels of rats in each group

表4 各組大鼠VEGF、ICAM-1及IL-1β水平比較(±s，n＝10)Table 4 Comparison of VEGF，ICAM-1 and IL-1β levels of rats in each group

注:與對照組相比，a P<0.05；與模型組相比，b P<0.05；與無菌檸檬酸組相比，c P<0.05。Note.Compared with the control group，a P<0.05.Compared with the model group，b P<0.05.Compared with the sterile citric acid group，c P<0.05.

組別Groups血管內皮生長因子(pg/mL)VEGF細胞間黏附分子-1(ng/L)ICAM-1白介素-1β(pg/mL)IL-1β對照組Control group 40.76±9.53 58.08±8.22 6.38±1.15模型組Model group 91.19±19.48a 89.65±19.71a 18.15±4.26a無菌檸檬酸組Sterile citric acid group 75.81±16.32ab 78.84±18.39ab 12.02±3.01ab VEGF抑制劑組VEGF inhibitor group 53.15±13.70abc 67.39±11.55abc 8.10±2.12abc 9.509 4.008 6.914 P 0.001 0.001 0.001 F

2.6 各組大鼠Ras、Raf-1及ERK表達量比較

如表5、圖2所示，與正常大鼠相比，模型組、無菌檸檬酸組、VEGF抑制劑組Ras、Raf-1及ERK表達量升高，具有顯著性差異(P<0.05)；與模型組相比，無菌檸檬酸組、VEGF抑制劑組Ras、Raf-1及ERK表達量降低，具有顯著性差異(P<0.05)；與無菌檸檬酸組相比，VEGF抑制劑組Ras、Raf-1及ERK表達量降低，具有顯著性差異(P<0.05)。

圖2 Ras、Raf-1及ERK蛋白表達Western blot圖Figure 2 Western blot of Ras，Raf-1 and ERK protein expression

表5 各組大鼠Ras、Raf-1及ERK表達量比較(±s，n＝10)Table 5 Comparison of the expression levels of Ras，Raf-1 and ERK in each group of rats

表5 各組大鼠Ras、Raf-1及ERK表達量比較(±s，n＝10)Table 5 Comparison of the expression levels of Ras，Raf-1 and ERK in each group of rats

注:與對照組相比，a P<0.05；與模型組相比，b P<0.05；與無菌檸檬酸組相比，c P<0.05。Note.Compared with the control group，a P<0.05.Compared with the model group，b P<0.05.Compared with the sterile citric acid group，c P<0.05.

組別Groups Ras Raf-1 ERK對照組Control group 1.34±0.41 1.45±0.23 0.73±0.14模型組Model group 5.82±1.64a 3.91±0.92a 2.42±0.78無菌檸檬酸組Sterile citric acid group 3.67±1.13ab 2.53±0.75ab 1.59±0.40 VEGF抑制劑組VEGF inhibitor group 1.98±0.62abc 1.90±0.51abc 1.05±0.21 12.010 5.885 9.242 P 0.001 0.001 0.001 Faababc

3 討論

在我國DR的發病率逐年上升，其主要是由多種因素共同作用導致的，是目前國內外導致低視力及致盲的重要疾病，不及時的有效治療會隨著病情發展導致失明，尋找有效的治療方法尤為重要[6]。隨著病程的不斷進展，DR促使其局部缺血缺氧，促使毛細血管通透性增加，促使新生血管生成等，新生血管會導致結締組織增生及玻璃體出血等，進一步增加視力喪失及視網膜脫離風險[7]。較多學者為臨床治療提高新的靶點，發現血管生成抑制因子與血管生成刺激因子之間的動態平衡在其發展與發生過程中具有重要作用[8]。VEGF其生物活性可以被抑制劑阻斷，是最重要的眼內新生血管生長因子，達到抑制新生血管生成的目的[9－10]。

視網膜CRA是供應視網膜內參的主要血管，屬于終末動脈，是眼動脈的分支，在維持視覺功能方面起重要的作用。視網膜動脈參數可用來反映視網膜的血液供應狀況，與視網膜微循環的狀態[11]。本文研究顯示，VEGF抑制劑能提高大鼠EDV、PSV水平升高，降低RI及PI水平，從而改善視網膜CRA血流動力學狀況。機體長時間處于高血糖狀態易造成血-視網膜屏障受損，血小板聚集性增強，同時視網膜毛細血管閉塞，視網膜血管彈性下降，促進新生血管形成，引起視網膜毛細血管增生與微血管瘤[12－13]。本文結果指出，VEGF抑制劑能降低大鼠全血粘度、血小板聚集率及血小板黏附率水平。脂聯素是脂肪細胞特異性分泌的一種蛋白質，在糖尿病合并癥的發展中具有重要的作用，其水平增高可引起微循環障礙[14]。本文中，與無菌檸檬酸組相比，VEGF抑制劑組脂聯素水平升高，FBG水平降低。

VEGF是血管內皮細胞特異的促有絲分裂素，過度表達會增加血管的滲透性，促進血管的異常增殖，其與組織中新生血管數量具有密切聯系，能特異性的作用于視網膜血管內皮細胞[15]。炎性細胞黏附與血管內皮細胞是由ICAM-1介導的，損害局部血管，導致活化氧自由基、炎癥遞質等，引起血管通透性增加，加重視網膜的損傷[16－17]。IL-1β在DR中加重視網膜病變，誘導ICAM-1等黏附因子，起關鍵作用的一種致炎因子[18]。本文指出，VEGF抑制劑通過能降低糖尿病性視網膜病變模型大鼠VEGF、ICAM-1及IL-1β水平，在抑制糖尿病性視網膜病變模型大鼠炎癥方面作用顯著。Ras/Raf-1/ERK通路是調控細胞增殖、凋亡與分化的重要途徑，是一個蛋白激酶級聯反應，在VEGF介導的血管生成信號通路上起促進VEGF表達的作用[19]。VEGF抑制劑相對分子量小，能夠穿透視網膜，與血管內皮生長因子特異性結合，加快緩解水腫，防治視網膜新生血管發生滲漏，阻止血管新生、再生，減輕炎癥反應，改善視網膜功能[20]。本文研究結果顯示，VEGF抑制劑對糖尿病性視網膜病變模型大鼠Ras、Raf-1及ERK蛋白表達有一定的調控作用，為其作用機制提供研究方向。本文研究的局限性主要體現在，本文研究實驗僅做了一個時間點的視網膜病變的觀察，在抑制糖尿病性視網膜病變發展這一結論研究方面，數據不充分，仍需要后續多試驗點加以證實。

綜上所述，VEGF抑制劑可改善糖尿病性視網膜病變模型大鼠CRA血流動力學與血液流變學指標，降低VEGF、ICAM-1及IL-1β水平，抑制血管新生。