基于NF-κB/IκBα信號通路探討“通經利濁”針法對急性痛風性關節炎大鼠保護作用的機制研究

齊 偉李 麗張 岳穆雙雙胡 德王淑敏*王朝輝*

(1.長春中醫藥大學針推學院，長春 130117；2.深圳市寶安純中醫治療醫院骨傷科，深圳 518101；3.長春中醫藥大學藥學院，長春 130117)

痛風是炎癥性關節炎的一種形式，是由于單鈉尿酸鹽(monosodium urate，MSU)晶體在人體組織和體液中的沉積所致。由于飲食和生活習慣的改變，在工業化國家中至少有4%的成年人受到痛風的困擾[1－2]。痛風的治療通常需要聯合使用抗炎藥物和降尿酸藥物，如非甾體抗炎藥/環氧化酶抑制劑、秋水仙堿、糖皮質激素、丙磺舒和別嘌醇[3]。盡管短期藥物治療對痛風有益，但痛風極易反復發作，同時長期藥物治療則會產生副作用[4]。綜上，臨床上迫切需要療效更好、安全性更高的抗痛風藥物及療法。

近期的研究多集中在尋找治療痛風性關節炎而無明顯不良反應的替代療法上。針灸是替代醫學的一種形式，因為它的不良反應發生率非常低，幾乎無副作用，并且在治療疼痛相關疾病中療效確切[5－6]，因此針灸在患者中很受歡迎。同時，探索針灸發揮療效的生化機制越來越受到重視。研究認為針刺刺激可以激活位于特定穴位深處的神經纖維和受體。皮膚和深部組織損傷可能伴隨著局部炎癥反應[7]。

針灸參與調節炎癥性疼痛已有文獻報道[8－10]。在弗氏佐劑誘導的炎癥模型中，電針可減輕炎癥劑引起的疼痛反應和脊髓中谷氨酸受體的表達[9]。在角叉菜膠誘發的炎癥模型中，針刺聯合亞有效劑量的N-甲基-D-天冬氨酸受體拮抗劑可延長抗痛覺反應的時間，且無明顯副作用[10]。另有研究表明，電針可抑制大鼠的脊髓背角星形膠質細胞活性，并減少了炎性細胞因子IL-6、IL-1和TNF-α的釋放[11]。此外，針刺可明顯抑制關節炎模型中IL-1β的上調[12]。鞘內注射IL-1受體拮抗劑可顯著緩解癌癥引起的痛覺反應，這表明針刺是通過抑制IL-1β的表達來緩解骨癌引起的疼痛[13]。

臨床觀察發現針刺對急性痛風性關節炎顯示出良好的治療效果[14]，針刺對MSU誘導的大鼠急性痛風性關節炎同樣有效[15]。針刺“通經利濁”針法是治療急性痛風性關節炎的有效臨床方法[16]。通經利濁針法取足陽明之足三里與足太陰之陰陵泉，均屬合穴，此兩穴相配有健脾、化濕通絡之功。再選取三陰交以活血化瘀、宣壅通絡、利尿通淋，促進濕濁邪氣從小便排出。此三穴共用，共奏清熱利濕，宣壅通絡之效。

但是，“通經利濁”針法針刺對急性痛風性關節炎的保護作用機制尚不清楚。本研究的目的是探討“通經利濁”針法針刺治療保護MSU誘導的大鼠急性痛風性關節炎的作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

從遼寧長生生物技術有限公司[SCXK(遼)2020-0001]購買了無特定病原級(specefic pathogen free，SPF)雄性SD大鼠40只，6周齡，體重(220±20)g。大鼠自由獲取食物和水，常規飼養1周。本研究經過長春中醫藥大學倫理委員會批準(IACUC-20190169)，在長春中醫藥大學動物中心喂養[SYXK(吉)2018-0014]，嚴格按照中國實驗動物管理法規處理動物，遵守3R原則。

1.2 主要試劑與儀器

秋水仙堿片(C22H25NO6，分子量:399.44)購自昆明制藥；單鈉尿酸鹽(C5H3N4O3Na，分子量:190.09)購自Sigma；IL-1β、IL-6和TNF-α試劑盒均購自南京建成；抗-p-NF-κBp65、抗-NF-κBp65、抗-p-IαBα、抗-IκBα等所有抗體均購自Cell Signaling Technology；小型動物麻醉機(VMR型)購自MATRX(美國)；電針儀(SDZ-V型)購自華佗。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物模型建立及分組

將動物分為4組(每組n＝10):(1)空白組；(2)模型組；(3)“通經利濁”針法組；(4)秋水仙堿組。秋水仙堿組大鼠口服秋水仙堿(1 mg/kg)7 d，而空白組和模型組則給予相同量的生理鹽水灌胃。針刺治療根據參考文獻[17]中的定位方法選擇“后三里”、“陰陵泉”、“三陰交”。使用小型動物麻醉機麻醉后，針刺“后三里”，直刺5 mm；“陰陵泉”，直刺5 mm；“三陰交”，直刺3 mm。針刺后用電針儀，以一側的后三里-三陰交為連續電針連接對穴，取連續波(2 Hz，0.6 mA，0.45 ms)行電針刺激，以大鼠的大腿輕輕抖動，不影響麻醉效果為度。每日針刺1次，每次10 min，7次為1療程，共干預1療程。針刺組和秋水仙堿組在急性痛風性關節炎模型建立前7 d接受治療。

1.3.2 急性痛風性關節炎模型

參照Shiels等[18]研究方法制備得到了MSU晶體，洗滌并風干。將250 mg MSU晶體溶于10 mL溶液(生理鹽水:聚山梨酯-80＝9∶1)中制得濃度為25 mg/mL的MSU溶液。第7天將此溶液注入右膝關節腔誘發急性痛風性關節炎模型后，即從雙眼眶后神經叢收集血液樣品1 mL，2500 r/min下離心15 min，將血清儲存在－20℃下保存直至使用。大鼠關節腔內注射MSU晶體后關節炎迅速出現，關節炎發生率100%[19]。具體表現為大鼠活動明顯減少，關節周圍局部出現紅斑、腫脹伴功能障礙，如行走遲緩、肢體不愿著力負重。顯微鏡下可見明顯的關節炎病理改變，確認造模成功[20]。

1.3.3 促炎癥細胞因子檢測

酶聯免疫吸附試驗測定IL-1β、IL-6、TNF-α水平:分離血清1 d后，根據生產商說明書進行操作，檢測血清中的促炎癥細胞因子水平。

1.3.4 組織病理學檢查

處死大鼠后，將膝蓋樣品在關節線上方和下方分別切開0.5 cm。然后將組織固定在10%中性福爾馬林緩沖液中，石蠟浸潤，包埋并制成5μm厚切片。用蘇木精和伊紅(HE)染色法將切片脫蠟并染色。在顯微鏡下以200倍的放大倍率觀察切片。

1.3.5 Western blot分析

將膝蓋樣品切成小塊后在RIPA裂解緩沖液中混合，在冰浴下勻漿。靜置30 min，將樣品在4℃下12000 r/min離心20 min。收集上清液，使用BCA試劑盒，以牛血清白蛋白作為標準品測定蛋白質濃度。將上清液加載到12%蛋白凝膠上，并用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離(120 V，200 mA，60 W，5 h)，蛋白質被轉移到PVDF膜上(300 V，200 mA，60 W，2 h)。用5%脫脂奶封閉2 h。將膜與單獨的一抗、抗-p-NF-κBp65、抗-NF-κBp65、抗-p-IαBα、抗-IκBα和抗GAPDH共同在4℃下孵育過夜，用TBST緩沖液洗滌后，將膜與二抗在室溫下孵育2 h。使用ECL化學發光檢測試劑盒對免疫反應性條帶成像，使用Image Lab 4.1(Bio-Rad)進行信號收集和光密度圖像分析。

1.4 統計學方法

采用SPSS 23.0軟件進行數據分析，結果以平均數±標準差(±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗，P<0.05被認為具有統計學意義。

2 結果

2.1 “通經利濁”針法針刺對促炎癥細胞因子的影響

與空白組相比，模型組的IL-1β、IL-6、TNF-α水平顯著升高(P<0.01)。通過“通經利濁”針法針刺治療可以顯著逆轉由MSU晶體引起的促炎癥細胞因子升高。秋水仙堿組與針法組的療效類似(圖1)。

圖1 “通經利濁”針法對促炎癥細胞因子的影響Figure 1 Effects of SMCTD acupuncture on serum proinflammatory cytokines.

2.2 “通經利濁”針法針刺對膝關節組織學變化的影響

在空白組動物的右膝關節病理切片中可觀察到正常的關節結構和骨關節(圖2A)。MSU晶體誘發的急性痛風性關節炎大鼠(模型組)表現出輕度滑膜水腫，關節間隙變小，關節侵蝕明顯(圖2B)。與之相反，秋水仙堿組(圖2C)和“通經利濁”針法組(圖2 D)抑制MSU晶體誘發的急性痛風性關節炎大鼠的關節侵蝕，關節間隙增加。

圖2 “通經利濁”針法對踝關節組織病理學檢查的影響Figure 2 Effects of SMCTD acupuncture on myocardial histopathological examination

2.3 “通經利濁”針法針刺對NF-κB信號通路的影響

本研究檢測“通經利濁”針法針刺或秋水仙堿預治療是否會影響NF-κB通路的活化。結果表明，通過MSU晶體處理可增加NF-κBp65含量，而通過“通經利濁”針法針刺或秋水仙堿預處理可有效降低其含量(P<0.01，P<0.01)(圖3A)。此外，MSU晶體激發導致了IκBα磷酸化和隨后的降解(圖3B)。然而，通過“通經利濁”針法針刺或秋水仙堿預處理，MSU晶體誘導的IκBα磷酸化降低(P<0.01)(圖3C)。上述結果均表明，“通經利濁”針法針刺的治療通過抑制NF-κB/IκBα信號通路的活化而發揮作用。

圖3 “通經利濁”針法對NF-кB信號通路的影響Figure 3 Effects of SMCTD acupuncture on NF-кB pathway

3 討論

尿酸單鈉晶體誘導的急性痛風性關節炎模型是由晶體沉積或急性結晶引起的。多項研究表明，MSU模型引起的癥狀與臨床觀察到的癥狀類似[21]，如水腫、紅斑以及跛行。MSU引起短暫的炎癥反應，其特征為在關節中的晶體沉積，同時伴有大量多形核中性粒細胞吞噬、炎癥性水腫和嚴重疼痛[22]。從本研究的組織病理學檢查結果來看，MSU可導致膝關節腫脹、跛行和傷害行為。“通經利濁”針法或秋水仙堿的預治療可顯著緩解MSU引起的機械性異常性疼痛，并減少嗜中性粒細胞向關節間隙的強烈浸潤。

炎癥是誘發急性痛風性關節炎的關鍵因素。在實驗研究中，炎癥過程是由MSU晶體在周圍組織中沉積引起的。MSU晶體與骨髓中的T淋巴細胞相互作用，活化炎癥小體，從而促進IL-6和IL-18產生[23]。活化的炎性細胞因子促進炎性介質的表達，這些介質負責T細胞的生長分化，是急性痛風性關節炎的主要病理特征[24]。此外，當前研究表明，活化的炎癥小體可觸發炎癥級聯反應并將幼稚T細胞極化為促炎性Th亞群，進而增強炎癥反應[25]。本研究中，炎癥應激與MSU引起的IL-1β、TNF-α和IL-6顯著升高相關。“通經利濁”針法針刺或秋水仙堿治療可明顯降低血清中IL-1β、TNF-α和IL-6的水平，這表明兩者的治療效果可能與抗炎特性有關。

促炎癥細胞因子的分泌和成熟受到NF-κB信號傳導的嚴格調節。研究表明疾病發生后組織周圍的吞噬細胞會被激活，分泌大量的促炎因子(如TNF-α、IL-1β和IL-6等)直接對周圍組織造成傷害，在細胞中，NF-κB通過與細胞質中的IκB家族相互作用而失活。具體過程如下:促炎癥因子激活NF-κB抑制蛋白(IkB)激酶復合體，使其磷酸化，經蛋白酶小體水解后，與NF-κB發生解離，解除其對NF-κB的抑制作用，進而暴露NF-κB的p50亞基，使其移位細胞核與靶基因啟動區或增強子的NF-κB位點結合，啟動促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6等基因的表達，使得TNF-α、IL-1β和IL-6等合成和分泌增加，進一步加劇損傷；反過來，上述促炎因子又可以加速活化NF-κB在組織間不斷擴散及NF-κB核移位，形成惡性循環[26－27]。當用MSU晶體刺激時，IκBα被IκB激酶復合物激活和降解，這使得NF-κB易位進入細胞核并與靶基因結合[28]。活化的NFκB增加了促炎癥細胞因子、趨化因子等的基因表達，最終導致了嚴重的炎癥反應[29]。本實驗結果表明，“通經利濁”針法針刺或秋水仙堿能抑制IκBα磷酸化和降解。此外，“通經利濁”針法針刺或秋水仙堿給藥，能減弱MSU晶體誘導引起的NF-κBp65核易位。

針灸是治療與痛風相關疾病(包括痛風性關節炎)的主流替代療法。其副作用小，很容易被患者接受。“通經利濁”針法是中醫治療痛風性關節炎的一種康復方法[30]。在臨床患者和實驗動物中，將穴位足三里、陰陵泉和三陰交聯合使用可有效治療痛風性關節炎[31－32]。在本研究中，經“通經利濁”針法針刺治療后顯著減輕了MSU引起的大鼠急性痛風性關節炎，這為“通經利濁”針法治療痛風性關節炎提供了進一步的實驗支持。

綜上，本研究表明“通經利濁”針法針刺對MSU晶體誘發的急性痛風性關節炎模型具有良好的療效，其作用機制可能是通過介導NF-κB/IκBα信號通路抑制促炎癥細胞因子。但仍存在不足，與T細胞亞群的關系仍需要進一步研究，相關實驗正在進行中。