hACE2-KI/NIFDC小鼠主要生物學特性指標測定

魏 杰王 洪劉甦蘇光姣娜周佳琪馮育芳秦 驍王莎莎范昌發付 瑞岳秉飛

(中國食品藥品檢定研究院，北京 102629)

血管緊張素轉化酶2(angiotensin converting enzyme 2，ACE2)是一種在體內有廣泛分布的鋅離子依賴蛋白酶。通過負性調節腎素-血管緊張素-醛固酮系統，在體內廣泛參與心腦血管、呼吸系統、泌尿系統、消化系統及腫瘤等生理和病理進程[1－7]。

2018年本單位以C57BL/6為背景鼠，通過將人源化的ACE2基因插入小鼠ACE2基因中構建了hACE2敲入小鼠，命名為hACE2-KI/NIFDC。該小鼠能適用于ACE2相關病理生理研究，并在2019-nCoV疾病研究、疫苗研發中發揮了重要作用[8－10]。

目前，尚沒有關于該小鼠主要生物學特性指標的報道。本研究首次通過對不同周齡hACE2-KI/NIFDC小鼠的臟器系數、生理生化的生物學指標的測定，為該模式小鼠提供更廣泛的應用基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

4周齡和8周齡雌性hACE2-KI/NIFDC小鼠各10只，SPF級，體重分別為13.5~16.9 g以及18.9~21.9 g，來自本單位模式動物室[SCXK(京)2017-0005]，飼養于IVC屏障環境[SYXK(京)2017-0013]，福利倫理審查由中國食品藥品檢定研究院福利倫理審查委員會審批(中檢動(福)第(B)021號)，實驗遵循3R原則。

1.2 主要試劑與儀器

Sartorius CPA 423電子天平(德國)；光電Mek7222血細胞分析儀(日本)；日立7080全自動生化分析儀(日本)。

生理檢測試劑(稀釋液DH640，分析清洗液DH520、DH620，溶血劑DH910、DH680)購自上海光電醫用電子儀器有限公司；生化檢測試劑購自中生北控生物科技股份有限公司，包含丙氨酸氨基轉移酶試劑盒(底物法)、天冬氨酸氨基轉移酶試劑盒(底物法)、總蛋白試劑盒(雙縮脲法)、白蛋白試劑盒(溴甲酚綠法)、堿性磷酸酶試劑盒(NPP底物-AMP緩沖液法)、尿素氮試劑盒(尿素酶-谷氨酸脫氫酶法)、肌酐試劑盒(氧化酶法)、葡萄糖試劑盒(己糖激酶法)、鈣(鄰甲酚酞絡合酮法)、無機磷試劑盒(磷鉬酸鹽法)、總膽固醇試劑盒(CHOD-PAP法)、總膽紅素試劑盒(釩酸鹽氧化法)和甘油三酯試劑盒(GPO-PAP法)。

1.3 實驗方法

小鼠禁食12 h，先編號稱體重，后眼靜脈采血術取20μL抗凝血和0.5 mL全血并分離血清，分別用于生理生化指標測定。小鼠處死后解剖臟器稱重，通過電子天平對各編號小鼠的心、肝、脾、肺、左右腎、左右腎上腺、左右卵巢進行稱重，并計算對應的臟器系數。22項血液生理指標和13項血液生化指標分別通過血細胞分析儀和生化分析儀測定。生理指標包括:白細胞計數(WBC)、紅細胞計數(RBC)、血小板計數(PLT)、血紅蛋白濃度(HGB)、平均紅細胞體積(MCV)、平均紅細胞血紅蛋白(MCH)、血紅蛋白濃度(MCHC)、紅細胞壓積(HCT)、平均紅細胞紅細胞分布寬度(RDW)、白細胞五分類計數、平均血小板體積(MPV)、血小板壓積(PCT)和血小板分布寬度(PDW)。生化指標包括:丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、堿性磷酸酶(ALP)、尿素(BUN)、肌酐(CREA)、葡萄糖(GLU)、鈣(CA)、磷(P)、總膽固醇(CHO)、總膽紅素(Tbili)和甘油三酯(TG)。

1.4 統計學方法

按照周齡和測定項目分類整理數據，結果以平均數±標準差(±s)表示，并用SPSS軟件作獨立樣本t檢驗統計分析組間差異。

2 結果

2.1 臟器系數測定結果

11項臟器系數指標中，8周齡組的脾、肺、胸腺、左腎、右腎占體重百分比均低于4周齡組(P<0.01)、心臟占體重百分比高于4周齡組(P<0.01)。肝、左腎上腺、右腎上腺、左卵巢、右卵巢占體重百分比兩組間無顯著性差異(表1)。

表1 4周齡和8周齡hACE2-KI/NIFDC的臟器系數比較Table 1 Organ coefficient comparison of 4-week-old and 8-week old hACE2-KI/NIFDC mice

2.2 生理指標測定結果

4周齡在MCV、MCH、EOS指標上高于與8周齡組(P<0.05)，在MON%指標上低于8周齡組。其余18項生理指標無顯著性差異(表2)。

表2 4周齡和8周齡hACE2-KI/NIFDC血液生理指標的比較Table 2 Blood physiological values comparison of 4-week old and 8-week-old hACE2-KI/NIFDCmice

2.3 生化指標測定結果

4周齡在AST、P兩項指標上顯著低于8周齡組(P<0.01)，在ALP指標上也低于8周齡組(P<0.05)。其余10項生化指標無顯著性差異(表3)。

表3 4周齡和8周齡hACE2-KI/NIFDC血液生化指標的比較Table 3 Serum biochemical values comparison of 4-week-old and 8-week-old hACE2-KI/NIFDC mice

3 討論

依據《實驗動物生物學數據采集技術規范》要求，測定小鼠的主要生物學特性通常選擇4周和8周齡小鼠，4周齡小鼠是免疫等常見應用初始周齡，8周齡則代表了成年小鼠的普遍水平。這一規范同樣適用于基因工程成小鼠。

hACE2-KI/NIFDC小鼠是學界公認的新型冠狀病毒肺炎疾病機理、藥物、疫苗的模式動物之一[11－14]。在研究評價中，通常需要測定實驗動物的臟體重量、生理生化指標來評價疾病健康狀態以及藥物疫苗的毒副作用。因此，測定不同周齡小鼠的生物學特性指標能夠為其應用建立基礎數據。但由于在新冠肺炎疾病研究中，該模型鼠供應緊張，本次生物學數據僅測定了4周齡和8周齡雌性。

臟器系數是反映動物內臟器官狀態的生物學指標，在毒性試驗和安全評價中經常通過臟器系數的變化來評價相關指標影響因素[15－17]。本研究中，8周齡組的脾、肺、胸腺、左腎、右腎占體重百分比均低于4周齡組(P<0.01)、心臟占體重百分比高于4周齡組(P<0.01)。隨著周齡增加，脾、肺、胸腺、左腎、右腎并未出現與體重一致的正相關增長，反映出了不同年齡器官功能的分化成熟狀態；只有心臟的臟器系數8周齡組高于4周齡組，反映出隨著周齡增長hACE2-KI/NIFDC小鼠的心臟供血能力增強。

血液生理生化指標是反映機體是否正常的兩類基礎指標。本研究測定的22項血生理指標和13項血生化指標中，僅MCV、MCH、EOS、MON%四項生理指標和AST、ALP、P三項生化指標在4周齡和8周齡雌性組間存在差異，反映了離乳后和性狀表達期兩個階段在造血、免疫和肝腎功能的差異MCV、MCH是反映紅細胞體積和血紅蛋白濃度指標，均存在4周齡高于8周齡的情況，這一結果也符合鼠成年后紅細胞體積減小以及血紅蛋白運氧功能成熟的情況。EOS是過敏反應指標，4周齡高于8周齡；MON%是細胞免疫指標，8周齡高于4周齡，這兩個指標的變化反映出隨著周齡增長，細胞免疫不斷成熟的狀態。其中3項生化指標均存在8周齡組高于4周齡組的情況。AST、ALP是評價肝功能的兩項指標，P是評價腎功能的指標。在應用該小鼠進行肝腎功能評價時，需要排除性別和周齡差異帶來的影響。較之常規品系，本研究中轉基因小鼠不同周齡差異化生理生化指標相對較少，這可能也與基因敲入有關[18]。在疫苗研發的動物實驗中，經常選用4~5周的小鼠進行免疫并定期觀察。對于雌性的該模型鼠，4周齡和8周齡組18項指標和10項生化指標均沒有統計學差異。但對于藥物評價通常使用某體重組的小鼠研究來說，沒有周齡界定，在評價生物學指標時也需要關注周齡變化可能帶來的影響。