Exendin-4對STZ誘導的糖尿病腎病大鼠的干預效果及作用機制研究

趙延輝解成霞

(青海紅十字醫院，西寧 810000)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)嚴重的并發癥之一，可導致嚴重腎衰竭。糖尿病腎病一旦出現持續性蛋白尿病情將無法逆轉，直至終末期腎衰竭，且糖尿病腎病的患病率逐年增加[1－2]。糖尿病代謝異常會直接導致腎小球硬化，進而導致腎功能損傷，因此臨床通過強化血糖控制來降低糖尿病腎病發生的風險。Exendin-4是一種腸降糖素類似物，由39個氨基酸組成的多肽，主要產生于蜥蜴(Gila monster lizard)的唾液腺中，能夠減輕體重，改善胰島細胞功能，呈劑量依賴性促進胰島素分泌，可發揮治療糖尿病腎病的作用[2－4]，但Exendin-4對于糖尿病所致腎病的作用研究較少。大量文獻報道激活的PDK1/Akt/mTOR通路參與了糖尿病腎病的發病過程，許多用于治療糖尿病腎病的藥物均與調控該通道相關[5－6]。因此在本文擬采用Exendin-4對鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)誘導的糖尿病腎病大鼠進行干預治療，為Exendin-4的臨床應用提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

無特定病原體動物(specific pathngen free animal，SPF)級SD健康雄性大鼠54只，體重(219.7±8.5)g，鼠齡(3.5±0.2)月；均購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司[SCXK(湘)2019-0004]。在青海大學醫學院動物實驗室[SYXK(青)2019-0001]中將SD大鼠均養殖在干凈籠子里，室溫(22.1±1.8)℃，相對濕度35%~40%，每天光照12 h，自由飲用純凈水，適應性飼養1周后開展實驗。本文研究所做實驗均獲得青海紅十字醫院倫理委員會批準(E20190015)，并滿足動物實驗學中的3R要求。

1.2 主要試劑與儀器

ME104E型電子分析天平(美國梅特勒-托利多公司)；SZX12-3111型顯微鏡(日本奧利巴斯公司)；DOTOP型全自動生化儀(廣州東唐電子科技有限公司)；Exendin-4(浙江鴻拓生物技術有限公司)；鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ，美國Sigma)；總膽固醇(total cholesterol， TG)、甘油三酯(triglycerides，TC)、高密度脂蛋白膽固醇(highdensity lipoprotein cholesterol，HDL))、低密度脂蛋白(low-density lipoprotein cholesterol，LDL)、淀粉酶(amylase，AMY)試劑盒(上海撫生實業有限公司)；血糖(blood glucose，BG)試劑盒(上海鈺博生物科技有限公司-儀器信息網)；糖化血紅蛋白(hemoglobin，HbAlc)和空腹血清胰島素(fasting serum insulin，FINS)試劑盒均購自南京基蛋生物科技有限公司；兔抗鼠晚期糖基化終末產物(advanced glycation end products，AGEs，艾美捷科技有限公司)、兔抗鼠PDK1抗體(艾美捷科技有限公司)；兔抗鼠p-Akt抗體(廈門研科生物技術有限公司)；兔抗鼠p-mTOR抗體(上海安研商貿有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組、建模及給藥

隨機選取60只大鼠中9只作為正常組，其余大鼠參照邵曉麗等[7]方法建立糖尿病腎病模型，對大鼠腹腔一次性注射STZ 60 mg/kg，當BG≥16.7 mmol/L，尿糖為＋＋＋＋以上表明糖尿病腎病大鼠模型建立成功。將糖尿病腎病大鼠隨機分為模型組、貝那普利組、Exendin-4低、中和高劑量組，每組各9只。貝那普利組灌胃10 mg/kg貝那普利片，Exendin-4低、中和高劑量組大鼠分別皮下注射Exendin-4 4、20、100μg/kg，正常組和模型組灌胃給予純凈水，灌胃或注射體積均為20μL/g。所有大鼠均連續給藥1周。

1.3.2 TG、TC、HDL、LDL水平檢測

給藥結束后，給予全麻，抽取腹主靜脈血5 mL置于抗凝管，5000 r/min離心10 min，取血漿，使用DOTOP型全自動生化儀檢測TG、TC、HDL、LDL水平。

1.3.3 BG、HbAlc和FINS

抽取腹主靜脈血5 mL，5000 r/min離心10 min，取血清，采用葡萄糖氧化酶法檢測BG；采用酶法檢測HbAlc；采用放射免疫法檢測FINS。

1.3.4 體重和腎臟指數(renal index，RI)、腎小球面積及腎小球直徑

給藥前及給藥結束稱量體重。給藥結束，取血結束，安樂處死大鼠，開腹取左腎和右腎，測重量，取左腎，采用10%的中性福爾馬林溶液固定，常規制片，光鏡下測量左腎和右腎的腎小球的直徑和面積，計算RI＝(左腎重量＋右腎重量)/體重×100%。

1.3.5 切片及染色

取“1.3.4”項下切片，脫水透明，浸蠟包埋，脫蠟、HE染色，鏡下觀察大鼠腎組織病理學表現。

1.3.6 AGEs及PDK1/Akt/mTOR通路蛋白檢測

取“1.3.4”項下右腎，使用Western blot檢測AGEs、PDK1、p-Akt、p-mTOR通路蛋白，提取腎組織中的樣品總蛋白，與上樣緩沖液按比例混合，煮沸5 min后，進行電泳，并將蛋白電轉至PVDF膜，使用5%的脫脂奶粉封閉1~2 h，然后加入一抗溶液TBST(AGEs、PDK1、p-Akt、p-mTOR按照1∶1000稀釋)，在4℃條件下震蕩過夜，再次洗滌，放入二抗，室內震蕩120 min后，洗滌，顯色成像，使用軟件分析蛋白條帶灰度值。內參蛋白是GAPDH。

1.4 統計學方法

采用SPSS 19.0統計軟件包進行統計分析處理。計量資料采用平均數±標準差(±s)描述，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用SNK檢驗，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 病理組織學觀察

如圖1所示，空白組腎小管結構正常，腎間質未見明顯的炎性細胞增生，模型組腎小球上皮細胞變性，腎小管周圍明顯炎性細胞浸潤，腎間質增寬，管腔內可見壞死脫落的上皮細胞，小管空泡變性萎縮；貝那普利組腎間質炎性細胞浸潤減少，腎小管上皮細胞腫脹和壞死程度減輕；Exendin-4各組的腎間質炎性細胞減少，管腔內壞死脫落的上皮細胞減少，小管變性萎縮空泡減少，其中Exendin-4中劑量組腎間質偶見炎性細胞，管腔內壞死脫落的上皮細胞明顯減少，腎病變改善明顯。

圖1 六組大鼠腎組織損傷情況HE染色圖Figure 1 HE staining of renal tissue injury in six groups of rats

2.2 六組大鼠TG、TC、HDL、LDL、AMY水平比較

如表1所示，模型組、貝那普利組、Exendin-4低、中和高劑量組大鼠血清TG、TC、LDL、AMY水平均高于空白組，HDL均低于空白組，具有顯著性差異(P<0.05)；貝那普利組、Exendin-4低、中和高劑量組大鼠TG、TC、LDL、AMY水平均低于模型組，HDL均高于模型組，具有顯著性差異(P<0.05)；Exendin-4低、中和高劑量組大鼠TG、TC、LDL、AMY水平均低于貝那普利組，HDL均高于貝那普利組，具有顯著性差異(P<0.05)；Exendin-4中和高劑量組大鼠TG、TC、LDL、AMY水平均低于Exendin-4低劑量組，HDL均高于Exendin-4低劑量組，具有顯著性差異(P<0.05)；Exendin-4高劑量組大鼠TG、TC、LDL、AMY水平均低于Exendin-4中劑量組，HDL均高于Exendin-4中劑量組，其中TC、HDL、LDL、AMY、HDL具有顯著性差異(P<0.05)。

表1 六組大鼠TG、TC、HDL、LDL、AMY水平比較(±s，n＝9)Table 1 Comparison of TG，TC，HDL，LDL and AMY levels in six groups of rats

表1 六組大鼠TG、TC、HDL、LDL、AMY水平比較(±s，n＝9)Table 1 Comparison of TG，TC，HDL，LDL and AMY levels in six groups of rats

注:與空白組相比，1)P<0.05；與模型組相比，2)P<0.05；與貝那普利組相比，3)P<0.05；與Exendin-4低劑量組相比，4)P<0.05；與Exendin-4中劑量相比，5)P<0.05。Note.Compared with blank group，1)P<0.05.Compared with model group，2)P<0.05.Compared with benazepril group，3)P<0.05.Compared with Exendin-4 low dose group，4)P<0.05.Compared with Exendin-4 medium dose group，5)P<0.05.

組別Groups總膽固醇(mmol/L)TG甘油三酯(mmol/L)TC高密度脂蛋白(mmol/L)HDL低密度脂蛋白(mmol/L)LDL淀粉酶(U/L)AMY空白組Blank group 1.35±0.11 0.93±0.06 2.99±0.15 2.19±0.06 1035.26±536.24模型組Model group 19.56±2.561) 3.89±0.151) 1.78±0.121) 4.99±0.151) 5698.35±658.691)貝那普利組Benazepril group 18.11±2.331)2) 3.75±0.131)2) 1.98±0.111)2) 4.71±0.121)2) 3125.26±625.391)2)Exendin-4低劑量組Exendin-4 low dose group 17.21±2.151)2)3) 3.21±0.111)2)3) 2.11±0.091)2)3) 3.86±0.111)2)3) 2435.26±513.241)2)3)Exendin-4中劑量組Exendin-4 medium dose group 13.15±1.561)2)3)4) 2.25±0.061)2)3)4) 2.55±0.111)2)3)4) 3.11±0.081)2)3)4) 1835.14±489.361)2)3)4 Exendin-4高劑量組Exendin-4 high dose group 12.89±1.461)2)3)4) 2.01±0.081)2)3)4)5) 2.89±0.111)2)3)4)5) 2.98±0.071)2)3)4)5) 1335.24±399.861)2)3)4 F 31.980 82.449 166.574 77.992 88.409 P 0.001 0.001 0.000 0.001 0.000))5)

2.3 六組大鼠BG、HbAlc、FINS水平比較

如表2所示，模型組、貝那普利組、Exendin-4低、中和高劑量組大鼠BG、HbAlc、FINS水平均高于空白組，具有顯著性差異(P<0.05)；貝那普利組、Exendin-4低、中和高劑量組大鼠BG、HbAlc、FINS水平均低于模型組，具有顯著性差異(P<0.05)；Exendin-4低、中和高劑量組大鼠BG、HbAlc、FINS水平均低于貝那普利組，具有顯著性差異(P<0.05)；Exendin-4中和高劑量組大鼠BG、HbAlc、FINS水平均低于Exendin-4低劑量組，具有顯著性差異(P<0.05)；Exendin-4高劑量組大鼠BG、HbAlc、FINS水平均低于Exendin-4中劑量組，但無顯著性差異(P>0.05)。

表2 六組大鼠BG、HbAlc、FINS水平比較(±s，n＝9)Table 2 Comparison of BG，HbAlc and FINSlevels in six groups of rats

表2 六組大鼠BG、HbAlc、FINS水平比較(±s，n＝9)Table 2 Comparison of BG，HbAlc and FINSlevels in six groups of rats

注:與空白組相比，1)P<0.05；與模型組相比，2)P<0.05；與貝那普利組相比，3)P<0.05；與Exendin-4低劑量組相比，4)P<0.05。Note.Compared with blank group，1)P<0.05.Compared with model group，2)P<0.05.Compared with benazepril group，3)P<0.05.Compared with Exendin-4 low dose group，4)P<0.05.

組別Groups血糖(mmol/L)BG糖化血紅蛋白(%)HbAlc空腹血清胰島(μU/mL)FINS空白組Blank group 8.62±1.26 28.46±3.11 15.26±2.13模型組Model group 29.88±1.891) 37.89±3.261) 33.69±6.881)貝那普利組Benazepril group 21.56±3.111)2) 33.15±3.151)2) 29.88±4.151)2)Exendin-4低劑量組Exendin-4 low dose group 19.88±2.151)2)3) 30.11±2.101)2)3) 26.15±3.121)2)3)Exendin-4中劑量組Exendin-4 medium dose group 12.56±1.151)2)3)4) 29.88±2.561)2)3)4) 19.51±2.131)2)3)4)Exendin-4高劑量組Exendin-4 high dose group 12.11±1.211)2)3)4) 29.16±2.111)2)3)4) 19.01±1.891)2)3)4)F 42.118 9.418 11.515 P 0.001 0.001 0.001

2.4 六組大鼠體重、RI、AGEs、腎小球面積、腎小球直徑比較

如表3和表4所示，模型組、貝那普利組、Exendin-4低、中和高劑量組體重、RI、AGEs、腎小球面積、腎小球直徑均高于空白組，具有顯著性差異(P<0.05)；貝那普利組、Exendin-4低、中和高劑量組大鼠體重、RI、AGEs、腎小球面積、腎小球直徑低于模型組，具有顯著性差異(P<0.05)；Exendin-4低、中和高劑量組大鼠體重、RI、AGEs、腎小球面積、腎小球直徑低于貝那普利組，具有顯著性差異(P<0.05)；Exendin-4中、高劑量組大鼠體重、RI、AGEs、腎小球面積、腎小球直徑低于Exendin-4低劑量組，具有顯著性差異(P<0.05)；Exendin-4高劑量組大鼠體重、RI、AGEs、腎小球面積、腎小球直徑低于Exendin-4中劑量組，其中體重、RI、腎小球面積具有顯著性差異(P<0.05)。

表3 六組大鼠體重、RI比較(±s，n＝9)Table 3 Comparison of weight，RI in six groups of rats

表3 六組大鼠體重、RI比較(±s，n＝9)Table 3 Comparison of weight，RI in six groups of rats

注:與空白組相比，1)P<0.05；與模型組相比，2)P<0.05；與貝那普利組相比，3)P<0.05；與Exendin-4低劑量組相比，4)P<0.05；與Exendin-4中劑量相比，5)P<0.05。Note.Compared with blank group，1)P<0.05.Compared with model group，2)P<0.05.Compared with benazepril group，3)P<0.05.Compared with Exendin-4 low dose group，4)P<0.05.Compared with Exendin-4 medium dose group，5)P<0.05.

組別Groups給藥前體重(g)Quality before administration給藥結束體重(g)End body mass腎臟指數RI空白組Blank group 219.12±8.65 244.36±8.67 0.21±0.02模型組Model group 221.52±9.02 296.95±8.341) 0.59±0.111)貝那普利組Benazepril group 215.96±7.98 265.69±8.291)2) 0.42±0.091)2)Exendin-4低劑量組Exendin-4 low dose group 221.09±7.46 284.36±7.361)2)3) 0.38±0.021)2)3)Exendin-4中劑量組Exendin-4 medium dose group 221.09±7.36 276.34±8.151)2)3)4) 0.25±0.031)2)3)4)Exendin-4高劑量組Exendin-4 high dose group 219.46±7.15 263.25±8.161)2)3)4)5) 0.24±0.021)2)3)4)5)F 0.611 45.135 15.295 P 0.692 0.000 0.001

表4 六組大鼠AGEs、腎小球面積、腎小球直徑比較(±s，n＝9)Table 4 Comparison of AGEs，glomerular area and glomerular diameter among the six groups

表4 六組大鼠AGEs、腎小球面積、腎小球直徑比較(±s，n＝9)Table 4 Comparison of AGEs，glomerular area and glomerular diameter among the six groups

注:與空白組相比，1)P<0.05；與模型組相比，2)P<0.05；與貝那普利組相比，3)P<0.05；與Exendin-4低劑量組相比，4)P<0.05；與Exendin-4中劑量相比，5)P<0.05。Note.Compared with blank group，1)P<0.05.Compared with model group，2)P<0.05.Compared with benazepril group，3)P<0.05.Compared with Exendin-4 low dose group，4)P<0.05.Compared with Exendin-4 medium dose group，5)P<0.05.

組別Groups晚期糖基化終末產物AGEs腎小球面積(unit)Glomerular area腎小球直徑(μm)Renal didiameter空白組Blank group 0.68±0.21 74.15±9.89 91.26±5.46模型組Model group 1.87±0.481) 119.45±12.221) 121.56±11.221)貝那普利組Benazepril group 1.05±0.351)2) 101.01±10.211)2) 114.33±10.251)2)Exendin-4低劑量組Exendin-4 low dose group 1.38±0.471)2)3) 98.02±9.881)2)3) 110.12±9.891)2)3)Exendin-4中劑量組Exendin-4 medium dose group 0.95±0.411)2)3)4) 81.25±7.891)2)3)4) 95.21±8.111)2)3)4)Exendin-4高劑量組Exendin-4 high dose group 0.59±0.281)2)3)4) 79.88±7.451)2)3)4)5) 94.11±8.261)2)3)4)F 14.140 12.967 10.927 P 0.000 0.001 0.001

2.5 六組大鼠腎組織PDK1/Akt/mTOR信號通路蛋白表達量比較

如表5、圖2所示，模型組、貝那普利組、Exendin-4低、中和高劑量組大鼠PDK1、p-Akt、p-mTOR蛋白表達量均高于空白組，具有顯著性差異(P<0.05)；貝那普利組、Exendin-4低、中和高劑量組大鼠PDK1、p-Akt、p-mTOR蛋白表達量低于模型組，具有顯著性差異(P<0.05)；Exendin-4低、中和高劑量組大鼠PDK1、p-Akt、p-mTOR蛋白表達量低于貝那普利組，具有顯著性差異(P<0.05)；Exendin-4中和高劑量組大鼠PDK1、p-Akt、p-mTOR蛋白表達量低于Exendin-4低劑量組，具有顯著性差異(P<0.05)；Exendin-4高劑量組大鼠PDK1、p-Akt、p-mTOR蛋白表達量低于Exendin-4中劑量組，但差異無顯著性差異(P>0.05)。

圖2 腎組織中PDK1/Akt/mTOR通路蛋白PDK1、p-Akt、p-mTOR蛋白Western blot圖Figure 2 Western blot of PDK1/Akt/mTOR pathway protein PDK1，p-Akt，p-mTOR protein in renal tissue

表5 六組大鼠腎組織PDK1/Akt/mTOR信號通路蛋白表達量比較(±s，n＝9)Table 5 Comparison of PDK1/Akt/mTOR signal pathway protein expression in six groups of rats

表5 六組大鼠腎組織PDK1/Akt/mTOR信號通路蛋白表達量比較(±s，n＝9)Table 5 Comparison of PDK1/Akt/mTOR signal pathway protein expression in six groups of rats

注:與空白組相比，1)P<0.05；與模型組相比，2)P<0.05；與貝那普利組相比，3)P<0.05；與Exendin-4低劑量組相比，4)P<0.05。Note.Compared with blank group，1)P<0.05.Compared with model group，2)P<0.05.Compared with benazepril group，3)P<0.05.Compared with Exendin-4 low dose group，4)P<0.05.

組別Groups磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1 PDK1磷酸化Akt p-Akt磷酸化mTOR p-mTOR空白組Blank group 1.01±0.03 0.98±0.03 1.05±0.02模型組Model group 2.89±0.021) 2.56±0.111) 2.45±0.101)貝那普利組Benazepril group 2.45±0.031)2) 2.31±0.031)2) 2.22±0.111)2)Exendin-4低劑量組Exendin-4 low dose group 2.01±0.011)2)3) 1.56±0.011)2)3) 1.58±0.061)2)3)Exendin-4中劑量組Exendin-4 medium dose group 1.25±0.021)2)3)4) 1.12±0.051)2)3)4) 1.22±0.011)2)3)4)Exendin-4高劑量組Exendin-4 high dose group 1.24±0.011)2)3)4) 1.11±0.011)2)3)4) 1.21±0.031)2)3)4)F 234.638 62.359 61.777 P 0.001 0.001 0.001

3 討論

糖尿病腎病是糖尿病患者進行腎移植常見原因，其病理特點為腎小球大量堆積、腎小管底膜增厚，導致腎小球硬化、腎小管纖維化，直至腎功能衰竭[8－10]。

Exendin-4能夠通過抑制胰高血糖素的分泌，延緩胃排空和食物的攝取量，進而減輕體重，本研究顯示，與糖尿病腎病模型組相比，給予不同劑量的Exendin-4可明顯減輕糖尿病腎病大鼠的體重，且呈Exendin-4劑量依賴性減低趨勢，進一步佐證Exendin-4可減輕體重。研究表明，Exendin-4可抑制TNF-α誘導的系膜細胞氧化應激和TGF-β1表達[11]，另外，Exendin-4能夠激活PPAR-α受體，減少載脂蛋白的合成，進而增加血漿中的脂肪降解和清除力度來調節脂代謝紊亂[12－13]。Exendin-4能夠通過增加胰島β細胞對葡萄糖的敏感性，促進血糖胰島素的分泌，改善糖代謝及脂代謝紊亂[14－15]。本研究顯示，Exendin-4中、高劑量組大鼠TG、TC、LDL、AMY水平均低于Exendin-4低劑量組，且Exendin-4高劑量組大鼠TG、TC、LDL水平均低于Exendin-4中劑量組，HDL的變化趨勢相反，該結果表明，Exendin-4可有效降低糖尿病腎病大鼠血液的TG、TC、LDL、AMY水平，提高HDL，且呈Exendin-4劑量依賴性趨勢，可見Exendin-4在改善脂代謝紊亂具有明確的效果。研究表明，Exendin-4可明顯抑制TNF-α誘導的系膜細胞MCP-1 mRNA的表達，并以劑量和時間依賴的方式抑制TNF-α誘導的系膜細胞培養上清內MCP-1、FN的含量，提示Exendin-4可能會對腎具有一定保護作用[16]。本研究顯示Exendin-4可顯著降低糖尿病腎病大鼠RI、腎小球面積、腎小球直徑，提示Exendin-4可改善腎功能。HbAlc能夠衡量血糖控制情況的重要指標，其可作為臨床評定糖尿病病情及治療預后的重要診斷依據[17]。本研究顯示，Exendin-4中、高劑量組大鼠BG、HbAlc、FINS、AGEs水平均低于Exendin-4低劑量組，且Exendin-4高劑量組大鼠BG、HbAlc、FINS、AGEs水平均低于Exendin-4中劑量組，該結果表明，Exendin-4能夠有效改善各組大鼠的血糖水平，可用于改善糖尿病腎病的糖代謝紊亂。

PDK1作為PI3K信號通路的重要傳導分子，是AGC蛋白激酶家族的一個蘇氨酸激酶，其與PIP3的結合能夠激活Akt等激酶，并且能夠通過調節AGC蛋白控制細胞的應答，在細胞的生長增殖和存活中發揮著重要作用[18－19]。p-mTOR屬于PIKK家族中的一員，其對調節細胞周期、蛋白質的合成發揮著重要的作用，在糖尿病發生時，高血糖能夠激活Akt而增加mTOR的活性，mTOR活性增加會促進腎小球和腎小管肥大[20－21]。本研究顯示，不同劑量Exendin-4干預大鼠，大鼠的PDK1、p-Akt、p-mTOR蛋白表達呈現與Exendin-4劑量負相關的趨勢，可見Exendin-4可在一定程度上通過調節PDK1、p-Akt、p-mTOR表達達到治療糖尿病腎病的目的。類似的報道，如Vasu等[22]認為Exendin-4作為多肽，可通過調節PDK1蛋白表達來降低高脂飲食誘導的β細胞增殖和凋亡。Zhang等[23]通過免疫印跡方法顯示，給衰老的成骨細胞Exendin-4干預，Exendin-4通過調節p-Akt表達，促進衰老成骨細胞的增殖，進而可用于預防老年性骨質疏松癥。Yu等[24]研究認為Exendin-4可通過調節mTOR表達來緩和葡萄糖對心肌細胞的毒性作用。

綜上所述，Exendin-4能夠減輕STZ誘導的糖尿病腎病大鼠的炎癥水平，改善其血糖、血脂水平，其作用機制可能與PDK1/Akt/mTOR通路受到抑制有關，為臨床上治療糖尿病腎病等其他炎癥病癥提供了新的方向。