內毒素血癥對大鼠腎功能及腎素-血管緊張素系統的影響分析

李晶鈴陰赪宏

(1.清華大學醫院內科，北京 100086；2.北京婦產醫院，北京 100026)

多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)是嚴重感染、創傷、大手術等原發病發生后，機體同時或序貫發生兩個及以上器官或系統功能障礙的臨床綜合征，病情兇險，病死率高，是ICU首位致死原因[1－2]。在MODS的病理進程中，各個器官和系統的損傷具有一定的規律性，其中腎首當其沖，往往先于其他器官出現功能異常[3－5]，而心血管和神經系統則通常為疾病的終末期表現。作為體內最大的代謝器官，肝是清除內毒素的主要工作站，也是內毒素攻擊的首要對象之一[6－7]。腎素-血管緊張素系統(RAS)廣泛存在于心、肝、腎、腦、肺等機體主器官中，前期研究發現，在這些器官受到損傷時，腎素-血管緊張素系統(RAS)會激活，表現為血管緊張素轉換酶(ACE)、血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)及其受體AT1R、AT2R表達升高。本研究重點分析內毒素血癥大鼠疾病發展的不同階段，腎功能以及腎中RAS的變化。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

健康清潔級(SPF)雄性Wistar大鼠90只，6~8周齡，體重250~270 g，購自中國醫學科學院實驗動物中心[SCXK(京)2017-003]，飼養于友誼醫院動物實驗室[SYXK(京)2018-0025]，本研究嚴格遵守3R原則，獲得了友誼醫院動物實驗管理與動物福利倫理委員會的倫理審批(CMU2016080135)。

1.2 主要試劑與儀器

NO化學法試劑盒(批號201912046)、內皮素(ET，批號202006157)、一氧化氮合酶(NOS，批號202006151)試劑盒購自南京建成生物工程研究所；血管緊張素轉換酶(ACE，批號20200715)試劑盒購自海軍總醫院；血管緊張素Ⅱ(AngⅡ，批號20200314)試劑盒購自北京市福瑞生物工程公司；AT1R、AT2R及內參引物(批號M12046，M12052)購自美國Santa Cruz公司；脂多糖(LPS，批號20200715)購自德國Sigma公司。智能放免測量儀(SN-6958型，上海原子能研究所日環儀器廠)；內毒素測定儀(BET-72型，上海精密儀器儀表有限公司)；小型垂直電泳與電轉印裝置(美國Bio-Rad公司)；高速低溫離心機(3K-18型，德國Sigma公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 模型制備與取樣方法

所有大鼠，適應性飼養1周，剔除體重過小或過大者，剩余90只。剩余大鼠隨機分為2組，對照組10只和模型組80只，模型組腹腔注射10 mg/kg LPS，對照組注射等體積無熱源水。分別于注射2、4、8、12、24、48、72、168 h隨機選取10只，1%戊巴比妥鈉30 mg/kg麻醉，取心臟血，室溫靜置2 h，離心取血清，離心重力2184 r/min，－20℃存儲，備用。之后摘取肺、腎、肝及心臟，生理鹽水沖洗干凈血液，分兩份，一份放入4%多聚甲醛液中固定備用，一份放入冷凍管中，于液氮中保存備用。

1.3.2 血清學指標檢測

采用內毒素測定儀測定內毒素水平；采用硝酸還原酶法測定一氧化氮(NO)水平；智能放射免疫測量儀和ELISA試劑盒測定內皮素(ET)、RAS標志物管緊張素轉換酶(ACEⅡ)、腎素(PRA)、血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)水平，比色法測定一氧化氮合酶(NOS)水平，全自動生化儀測定腎功能指標血肌酐、尿素氮水平。

1.3.3 HE染色實驗觀察腎病理后特征

取對照組和模型組LPS注射24 h的多聚甲醛固定的腎組織，采用常規石蠟包埋的方法制備病理切片，切片厚度5~7μm，留作HE染色實驗，1周內檢測。主要步驟:二甲苯脫蠟，即將病理切片浸泡于二甲苯中10 min，反復操作兩次。梯度乙醇水化，依次采用無水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇、蒸餾水浸泡1~3 min。蘇木素染色10 min，流水沖洗干凈染液，加入1%的鹽酸乙醇分化3 s，流水沖洗，返藍染色液返藍。蘇木素復染后，梯度乙醇脫水，75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇依次浸泡3~5 min，無水乙醇浸泡2次，每次10 min。二甲苯透明，中性樹膠封片，電子顯微鏡下觀察腎小管和腎小球結構。

1.3.4 免疫蛋白印跡實驗(Western blot)檢測腎組織AT1R和AT2R的蛋白表達

液氮保存的腎組織，冰上自然解凍，采用蛋白質提取試劑盒提取蛋白質，BCA法定量蛋白濃度，并采用5×buffer緩沖液配置為1μg/μL的溶液，采用Western blot測定RAS標志物AT1R和AT2R的表達水平。組裝Western blot的電泳槽，配置濃縮膠、分離膠和電泳液，預備SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。在點樣前，先以40 V電泳30 min，以排除膠體內的雜志，然后點樣，每孔點樣10μL，60 V電泳30 min通過濃縮膠，80 V電泳60 min通過分離膠。經電泳后，蛋白質按照分子量大小自分離膠中分離開來，形成蛋白條帶，將此條帶轉印至羥甲基纖維素(NC)膜，轉印條件，80 V×60 min。轉印成功后，將NC膜封入5%的脫脂牛奶，37℃震蕩搖勻90 min，封閉非特異性條帶。PBST液清洗3次，每次5 min，一抗孵育，AT1R、AT2R的一抗濃度均為1∶2000，內參GAPDH的濃度為1∶2500，4℃震蕩搖勻過夜。PBST液清洗3次，每次5 min，二抗孵育，濃度均為1∶2500，37℃震蕩搖勻60 min。滴加ECL發光液，暗室顯影。采用影像分析軟件Image J分析灰度值，目的蛋白表達量＝目的條帶灰度值/內參條帶灰度值。

1.4 統計學方法

采用SPSS 22.0軟件分析數據，本組均為計量資料，符合正態分布，方差齊，以平均數±標準差(±s)表示，方差分析有統計學差異者進一步采用LSD-t檢驗分析兩組間差異。P<0.05有統計學意義。

2 結果

2.1 內毒素和氧化應激標志物

模型組大鼠循環LPS在注射后迅速升高，2 h達峰，168 h降至正常水平，中間時間段均高于對照組(P<0.05)。內皮素、NO與NOS在注射后逐漸升高，12 h達峰，NO在4~48 h高于對照組，內皮素和NOS在2~48 h高于對照組，差異具有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 各組大鼠內毒素和氧化應激標志物水平變化Figure 1 Level changes of endotoxin and oxidative stress biomarkers between groups

2.2 腎病理

對照組大鼠的腎小管排列整齊，基本無炎性細胞浸潤；腎小球形態完整，基底膜清晰。模型組大鼠腎小管結構萎縮，排列紊亂，可見大量紅色的炎性細胞浸潤；腎小球體積增大，基底膜不清，可見彌漫性系膜增生和紅色的炎性細胞浸潤，偶見新月體形成。見圖2。

圖2 對照組與模型組大鼠腎病理特征比較Figure 2 Comparison of renal pathological features between control group and model group

2.3 腎臟指數和腎功能

模型組大鼠腎臟系數在LPS注射后逐漸升高，在8~12 h達峰，在2~168 h高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；模型組血肌酐和尿素氮在LPS注射后逐漸升高，在8~12 h達峰，2~168 h之間的水平均高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖3。

圖3 各組大鼠腎系數和腎功能指標水平變化Figure 3 Level changes of renal coefficient and renal function index between groups

2.4 血清RAS標志物

模型組大鼠循環PRA在注射后迅速升高，2 h達峰，48 h降至正常水平，中間時間段均高于對照組(P<0.05)。ACE和AngⅡ在注射后逐漸升高，8 h達峰，ACE在2~24 h高于對照組，AngⅡ在2~48 h高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖4。

圖4 各組大鼠血清RAS標志物水平變化Figure 4 Changes of serum RASmarkers of rats between groups

2.5 腎組織AT1R和AT2R的表達

對照組大鼠各個時間點腎AT1R和AT2R表達水平較為一致，無明顯波動。模型組大鼠AT1R和AT2R在LPS注射后逐漸升高，腎組織AT1R和AT2R在8 h達到高峰，2~168 h之間的水平均高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖5。

圖5 各組大鼠腎AT1R和AT2R的表達變化Figure 5 Changes of AT1R and AT2R expression in the kidneys between groups

3 討論

RAS是人體內重要的體液調節系統，對人體的免疫、內分泌和代謝功能均有調節作用，在循環系統中的作用報道較多，其主要活性分子AngⅡ廣泛分布于血管平滑肌細胞，可促進血管內皮細胞增殖、血管收縮和局部炎性反應[8]。國內學者孫天孚[9]檢測顱內動脈瘤患者血液、腦脊液、動脈瘤壁上的RAS相關蛋白ACE、AngⅡ、AT1R的表達水平，證實顱內動脈瘤循環和腦組織的RAS均被激活，且其相關蛋白的表達水平與炎性因子呈正相關性。在腦梗死、慢性腎病及高血壓疾病中，也有循環RAS被激活的相關報道[10]。隨著病理研究的深入進展，研究者們發現RAS廣泛分布于機體的各個器官，并參與了各種原因導致的器官損傷，其中腎、心臟和腦最先受到重視。現有研究已證實高血壓所致腎損傷、原發性腎、糖尿病腎病及免疫相關腎病中均存在RAS過度激活[11－12]，RAS抑制劑和拮抗劑也已用于臨床，在改善高血壓所致腎功能損傷方面取得了積極作用[13－14]。學者Yang等[15]對比分析了119例合并心血管病變患者和241例無心血管病變患者的血液透析資料，發現合并心血管病者循環ACE/ACE2比值明顯升高，暗示著心血管系統病變可加重全身RAS功能異常。后有學者指出心臟內部存在局部RAS，其功能變化可預測慢性心力衰竭患者的預后[16]。

內毒素血癥是一種以MODS為主要病理表現的危重病，發病過程累及多個器官與系統，本研究重點考察腎中RAS的變化。研究采用直接注射內毒素LPS的方式制備內毒素血癥大鼠模型，注射后，大鼠循環系統內毒素水平可在LPS注射后2 h即可達到峰值，并持續保持在一個較高的水平，這與其他學者的既往報道結果基本一致。隨后內皮素和氧化應激標志物NO、NOS水平也相繼升高，在12 h達到高峰。氧化應激損傷以及內皮功能異常是內毒素血癥引發血管和器官損害的重要機制，這幾項指標跟隨內毒素波動而波動是內毒素血癥模型制備成功的側面反映。

本研究發現在注射LPS以后腎臟系數、血肌酐和尿膽素逐漸升高，腎功能各個指標達到峰值的時間相差不大，均為8~12 h，說明腎功能也受到了較大損害。大鼠血清ACEⅡ、PRA、AngⅡ也在LPS注射后12 h內達到峰值，這說明RAS的發生與內毒素血癥所致的腎與肝損傷可能是同時發生的。為分析內毒素血癥發病過程中腎RAS的變化，本研究對腎組織的AT1R和AT2R表達水平也做了檢測。AT1R和AT2R是AngⅡ的重要受體，AngⅡ為RAS的兩大主要活性分子之一，這一分子主要通過與其受體AT1R和AT2R結合而發揮作用。研究表明，AT1R被激活可誘導炎性反應、細胞外基質合成和細胞增殖，參與炎性浸潤、氧化應激損傷、組織器官纖維化損傷、腫瘤微血管生成和腫瘤細胞遷移等病理行為[17－18]。AT2R被激活可調節血管壓力、內分泌與代謝功能[19－20]。在內毒素血癥中，AT1R和AT2R共同參與了器官損傷機制。本研究結果顯示，腎組織的AT1R和AT2R表達變化在LPS注射后8 h達到高峰，說明內毒素血癥所致腎損傷中可能有RAS的參與。

綜上所述，本研究分析了內毒素血癥大鼠模型發病的不同時間點腎損傷及局部RAS的變化，發現腎損傷過程中伴隨著組織AT1R和AT2R的表達異常，認為內毒素血癥所致腎損傷中可能有RAS的參與。