敗醬草對對乙酰氨基酚誘導的大鼠藥物性肝損傷的保護作用

唐文誠何 清宋大萍沈政洪王繼生*

(1.西南醫科大學藥學院，四川 瀘州 646000；2.綿陽市第三人民醫院·四川省精神衛生中心，四川 綿陽 621000)

藥物引起的肝損傷是急性肝衰竭的主要原因，這是由于人體中累積的藥物代謝為有毒物質，并有助于產生嚴重的氧化應激，炎癥和細胞凋亡，從而誘發肝細胞壞死最終損害肝[1]。盡管藥物性肝損傷臨床發病率相對較低，但在發達國家，它仍然是急性肝衰竭的常見原因[2]。對乙酰氨基酚(paracetamol，APAP)是世界上最受歡迎和最安全的止痛藥之一，然而由于其廣泛的可用性，它經常涉及有意或無意的過量使用，可導致嚴重的肝損傷，目前廣泛用于臨床建立藥物性肝損傷動物模型[3－4]。

近年來的研究表明，由于中草藥具有治療作用，被認為是改善肝和其他疾病的潛在藥物[5]。敗醬草(herba patriniae)是多年生中草藥，含有氨基酸、維生素、礦物質和生物堿等有益成分，具有抗氧化、抗菌、消除血瘀，促進肝細胞再生和減輕焦慮的作用[6]。已有研究表明白花敗醬草醇提物通過抗氧化及抑制肝細胞凋亡而改善四氯化碳誘導的小鼠急性肝損傷[7]，說明敗醬草的肝保護作用。但敗醬草對藥物性肝損傷的具體作用機制尚未見報道，本文旨在探究敗醬草對對乙酰氨基酚誘導的大鼠藥物性肝損傷的保護作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

60只SD清潔級大鼠，雄性，12周齡，體重280±10 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[SCXK(京)2016-0011]，動物合格證編號:11400700183999，常規飼喂。所有大鼠均飼養于西南醫科大學SPF動物房[SYXK(川)2018-065]。本研究經綿陽市第三人民醫院倫理委員會批準(IACUC-2020D127-21)，實驗設計及實施過程中嚴格遵循動物實驗的3R原則。

1.2 主要試劑與儀器

敗醬草(121271-201201)、對乙酰氨基酚(100018-201610)購自中國食品藥品檢定研究院；聯苯雙酯(T3273)購自美國Target Molecule Corp公司；蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色試劑盒(C0105M)、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(H＋L)(A0208)購自上海碧云天生物技術有限公司；丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase，ALT)測試盒(C009-2-1)、天門冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase，AST)測試盒(C010-2-1)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)測定試劑盒(A059-1-1)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)測定試劑盒(A003-1-2)、總超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)測定試劑盒(A001-3-2)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)測定試劑盒(A005-1-2)購自南京建成生物工程研究所；TNF-α(JK-(a)-0016)、IL-6(JK-(a)-1498)、IL-1β(JK-(a)-E06517)ELISA測試盒購自上海晶抗生物工程有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物模型建立及分組

將大鼠隨機分為6組:對照組、模型組、敗醬草低劑量組、敗醬草中劑量組、敗醬草高劑量組、聯苯雙脂組，每組10只。除對照組外，其余各組參照王茜等[8]方法每日灌胃對乙酰氨基酚1000 mg/kg，每日1次，連續30 d復制肝損傷模型。造模同時，敗醬草低劑量組、敗醬草中劑量組和敗醬草高劑量組每日灌胃敗醬草4、8、16 g/kg[9]，聯苯雙脂組每日灌胃聯苯雙脂0.3 g/kg[10]，對照組和模型組灌胃等量生理鹽水，連續30 d。

1.3.2 肝臟指數

最后1次灌胃12 h后，測量各組大鼠重，處死所有大鼠，測量體重，計算肝臟指數。肝臟指數＝肝重量(g)/體重(g)×100%。

1.3.3 HE染色

將各組大鼠肝組織于4%多聚甲醛中固定72 h，隨后對已固定的肝組織置于20%乙二胺四乙酸中進行脫鈣處理，將樣品在梯度濃度的乙醇中脫水并包埋在石蠟中。將石蠟包埋的組織切成5 mm切片，于室溫下進行蘇木精染色10 min，伊紅染色2 min。使用光學顯微鏡觀察肝組織病理學變化。

1.3.4 血清生化指標

按照試劑盒說明書，采用酶標儀測定血清中ALT、AST和ALP水平。ALT、AST在510 nm處測OD值，AKP在520 nm處測OD值。

1.3.5 ELISA

取各組大鼠肝組織，滴入含有蛋白酶抑制劑的冰緩沖液，制作成勻漿液，離心收集上清液。按照ELISA試劑盒說明書測定肝組織上清液TNF-α、IL-6和IL-1β的水平。

1.3.6 氧化應激

按照試劑盒說明書，采用酶標儀測定肝組織勻漿中SOD含量，采用可見分光光度計測定丙二醛MDA、GSH-Px含量。SOD在450 nm處測OD值，MDA在532 nm處測OD值，GSH在412 nm處測OD值。

1.4 統計學方法

用統計軟件SPSS 19.0對所有實驗數據進行統計分析，組間差異采用t檢驗或單因素方差分析進行檢驗。結果以平均數±標準差(±s)表示。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 敗醬草降低對乙酰氨基酚誘導的藥物性肝損傷大鼠肝臟指數

與對照組相比較，模型組肝臟指數顯著升高(P<0.05)。與模型組相比較，敗醬草中、高劑量組和聯苯雙酯組肝臟指數顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 敗醬草對對乙酰氨基酚誘導的藥物性肝損傷大鼠肝臟指數的影響(±s，n＝10)Table 1 Effect of herba patriniae on hepatic index in rats with paracetamol-induced drug-induced liver injury

表1 敗醬草對對乙酰氨基酚誘導的藥物性肝損傷大鼠肝臟指數的影響(±s，n＝10)Table 1 Effect of herba patriniae on hepatic index in rats with paracetamol-induced drug-induced liver injury

注:與對照組相比，*P<0.05；與模型組相比，＃P<0.05。Note.Compared with control group，*P<0.05.Compared with model group，＃P<0.05.

組別Groups劑量(g/kg)Dose肝臟指數(%)Liver index對照組Control gourp 0 2.8±0.4模型組Model group 0 4.5±0.9*敗醬草低劑量組Low dose herba patriniae group 4 3.2±0.2＃敗醬草中劑量組Medium dose herba patriniae group 8 3.3±0.3＃敗醬草高劑量組High dose herba patriniae group 16 3.1±0.3＃聯苯雙酯組Bifendatatum group 0.3 3.2±0.3＃

2.2 敗醬草改善對乙酰氨基酚誘導的藥物性肝損傷大鼠肝組織病理損傷

對照組肝細胞排列整齊，結構完整。模型組細胞排列紊亂，有明顯出血，大量炎性細胞浸潤。敗醬草中、高劑量組和聯苯雙酯組細胞排列較整齊，出血明顯減少，炎性細胞浸潤減少。見圖1。

圖1 敗醬草對對乙酰氨基酚誘導的藥物性肝損傷大鼠肝組織病理損傷的影響Figure 1 Effect of herba patriniae on pathological injury of rat liver tissue induced by paracetamol-induced drug-induced liver injury

2.3 敗醬草降低對乙酰氨基酚誘導的藥物性肝損傷大鼠AST、ALT、ALP水平

與對照組相比較，模型組AST、ALT、ALP水平顯著升高(P<0.05)。與模型組相比較，敗醬草低、中、高劑量組和聯苯雙酯組AST、ALT、ALP水平顯著降低(P<0.05)。見表2。

表2 敗醬草對對乙酰氨基酚誘導的藥物性肝損傷大鼠AST、ALT、ALP水平的影響(±s，n＝10)Table 2 Effects of herba patriniae on AST，ALT and ALP levels in rats with paracetamol-induced drug-induced liver injury

表2 敗醬草對對乙酰氨基酚誘導的藥物性肝損傷大鼠AST、ALT、ALP水平的影響(±s，n＝10)Table 2 Effects of herba patriniae on AST，ALT and ALP levels in rats with paracetamol-induced drug-induced liver injury

注:與對照組相比，*P<0.05；與模型組相比，＃P<0.05。Note.Compared with control group，*P<0.05.Compared with model group，＃P<0.05.

組別Groups劑量(g/kg)Dose天門冬氨酸氨基轉移酶(U/L)AST丙氨酸氨基轉移酶(U/L)ALT堿性磷酸酶(U/L)ALP對照組Control gourp 0 187.34±27.31 31.80±5.12 115.74±8.53模型組Model group 0 342.66±15.77* 104.67±18.36* 158.47±14.25*敗醬草低劑量組Low dose herba patriniae group 4 310.38±12.03 94.51±18.79 145.33±12.86敗醬草中劑量組Medium dose herba patriniae group 8 287.32±10.58＃ 77.36±14.07＃ 132.34±9.85＃敗醬草高劑量組High dose herba patriniae group 16 230.78±11.57＃ 68.45±10.75＃ 112.53±15.31＃聯苯雙酯組Bifendatatum group 0.3 227.86±10.91＃ 65.18±10.17＃ 110.76±9.34＃

2.4 敗醬草降低對乙酰氨基酚誘導的藥物性肝損傷大鼠TNF-α、IL-6、IL-1β水平

與對照組相比較，模型組TNF-α、IL-6、IL-1β水平顯著升高(P<0.05)。與模型組相比較，敗醬草低、中、高劑量組和聯苯雙酯組TNF-α、IL-6、IL-1β水平顯著降低(P<0.05)。見表3。

表3 敗醬草對對乙酰氨基酚誘導的藥物性肝損傷大鼠TNF-α、IL-6、IL-1β水平的影響(±s，n＝10)Table 3 Effects of herba patriniae on TNF-α，IL-6 and IL-1βlevels in rats with paracetamol-induced drug-induced liver injury

表3 敗醬草對對乙酰氨基酚誘導的藥物性肝損傷大鼠TNF-α、IL-6、IL-1β水平的影響(±s，n＝10)Table 3 Effects of herba patriniae on TNF-α，IL-6 and IL-1βlevels in rats with paracetamol-induced drug-induced liver injury

注:與對照組相比，*P<0.05；與模型組相比，＃P<0.05。Note.Compared with control group，*P<0.05.Compared with model group，＃P<0.05.

組別Groups劑量(g/kg)Dose腫瘤壞死因子α(pg/mL)TNF-α白介素6(pg/mL)IL-6白介素1β(pg/mL)IL-1β對照組Control gourp 0 141.36±5.37 49.72±12.51 24.32±4.33模型組Model group 0 357.93±6.57* 193.37±19.44* 159.16±4.52*敗醬草低劑量組Low dose herba patriniae group 4 196.86±5.53＃ 145.44±13.85＃ 140.97±5.63＃敗醬草中劑量組Medium dose herba patriniae group 8 161.85±6.41＃ 127.61±15.01＃ 94.85±5.17＃敗醬草高劑量組High dose herba patriniae group 16 121.74±6.36＃ 104.95±15.93＃ 52.60±4.47＃聯苯雙酯組Bifendatatum group 0.3 149.19±6.74＃ 120.9±10.45＃ 40.27±3.25＃

2.5 敗醬草升高對乙酰氨基酚誘導的藥物性肝損傷大鼠SOD、GSH-Px含量，降低MDA含量

與對照組相比較，模型組SOD、GSH-Px含量顯著降低(P<0.05)、MDA含量顯著升高(P<0.05)。與模型組相比較，敗醬草低、中、高劑量組和聯苯雙酯組SOD、GSH-Px含量顯著升高(P<0.05)、MDA含量顯著降低(P<0.05)。見表4。

表4 敗醬草對對乙酰氨基酚誘導的藥物性肝損傷大鼠SOD、MDA、GSH-Px含量的影響(±s，n＝10)Table 4 Effects of herba patriniae on SOD，MDA and GSH-Px levels in rats with paracetamol-induced drug-induced liver injury

表4 敗醬草對對乙酰氨基酚誘導的藥物性肝損傷大鼠SOD、MDA、GSH-Px含量的影響(±s，n＝10)Table 4 Effects of herba patriniae on SOD，MDA and GSH-Px levels in rats with paracetamol-induced drug-induced liver injury

注:與對照組相比，*P<0.05；與模型組相比，＃P<0.05。Note.Compared with control group，*P<0.05.Compared with model group，＃P<0.05.

組別Groups劑量(g/kg)Dose總超氧化物歧化酶(U/mg Pro)SOD丙二醛(nmol/mg Pro)MDA谷胱甘肽過氧化物酶(U/mg Pro)GSH-Px對照組Control gourp 0 237.13±30.39 9.37±0.59 15.72±0.43模型組Model group 0 90.31±10.58* 11.25±0.42* 5.6±0.45*敗醬草低劑量組Low dose herba patriniae group 4 167.64±24.54＃ 10.82±0.89＃ 7.8±0.56＃敗醬草中劑量組Medium dose herba patriniae group 8 189.92±16.41＃ 10.17±0.62＃ 9.3±0.81＃敗醬草高劑量組High dose herba patriniae group 16 217.54±26.39＃ 9.54±0.93＃ 11.24±0.44＃聯苯雙酯組Bifendatatum group 0.3 226.71±16.73＃ 9.22±0.46＃ 13.18±0.32＃

3 討論

藥物性肝損傷又稱藥物性肝病，由于化學藥品數目增多及生物制劑和保健品的濫用，藥物性肝損傷的發病率呈上升趨勢[11]。建立APAP誘導的藥物性肝損傷模型是研究藥物保肝護肝活性的經典方法，以期進一步研究藥物性肝損傷的機制，為開發安全高效藥的新奠定基礎。本文研究發現，敗醬草具有改善APAP誘導的藥物性肝損傷大鼠病理損傷程度，降低肝臟指數的作用。

天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)和堿性磷酸酶(ALP)是常見的反應肝損傷的生化標志物，當肝細胞受損時，細胞膜通透性改變，AST、ALT、ALP釋放進入血液，導致血清中AST、ALT、ALP水平升高[12－13]。本文研究發現，敗醬草具有降低APAP誘導的藥物性肝損傷大鼠AST、ALT、ALP水平的作用，提示敗醬草對APAP誘導的藥物性肝損傷大鼠具有降酶保肝作用。

肝損傷嚴重程度取決于炎癥因子的釋放程度，由于炎癥反應參與APAP誘導的藥物性肝損傷的發生發展過程，抑制炎癥因子的釋放有助于治療APAP誘導的藥物性肝損傷[14]。IL-6屬于參與機體免疫應答的炎癥因子，其含量升高可引發內臟功能性損害，同時使T淋巴細胞增殖、分化，從而加劇機體炎癥反應[15]。TNF-α是肝中重要的促炎、免疫調節因子，可引發肝組織炎細胞聚集，IL-1β在多種臟器中起重要作用，其高表達預示著炎癥的發生[16]。韓亮等[17]研究發現敗醬草通過下調TNFα、IL-1β水平減輕潰瘍性結腸炎大鼠結腸的組織學損傷程度。Seo等[18]研究發現黃花敗醬提取物能抑制急性胰腺炎大鼠炎癥細胞因子的表達。本文研究發現，敗醬草具有降低APAP誘導的藥物性肝損傷大鼠TNF-α、IL-6、IL-1β水平的作用。提示敗醬草抑制APAP誘導的藥物性肝損傷大鼠炎癥因子的釋放。

APAP誘導藥物性肝損傷的過程中，大量的氧自由基量生成和氧化應激次數的增多會加重肝損傷過程[19]。MDA是脂質發生過氧化反應的氧化終產物，測定MDA含量可反映機體脂質過氧化的程度，SOD在人體中水平高低可間接反映機體清除自由基的能力。測定MDA及SOD含量，可有助于分析肝損傷程度和肝修復能力。GSH-Px可衡量機體抗氧化能力強弱，測定肝組織中GSH-Px含量能較好的反映機體抗氧化的能力，間接反映肝細胞膜的修復程度[20]。孟良玉等[21]研究發現敗醬草提取物可顯著降低小鼠血清及組織MDA含量，提高SOD、GSH-Px和CAT活力。本文研究發現，敗醬草具有升高APAP誘導的藥物性肝損傷大鼠SOD、GSH-Px含量，降低MDA含量。提示敗醬草通過抗氧化應激對APAP誘導的藥物性肝損傷大鼠具有保護作用。

綜上所述，敗醬草通過改善肝組織病理損傷，降低血清生化酶水平，抑制炎癥因子的釋放，減輕氧化應激水平對APAP誘導的藥物性肝損傷模型大鼠具有保護作用。為臨床應用敗醬草治療藥物性肝損傷提供了一定實驗依據，但敗醬草對APAP誘導的藥物性肝損傷的具體分子作用機制還需進一步實驗探討。