精漿外泌體在精子發生與功能調控中的研究進展

薛林濤 黃悅悅 施文

【關鍵詞】 精漿外泌體;精子發生;功能調控

中圖分類號：R711.6?? 文獻標志碼：A?? DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2021.09.014

精漿是精子運輸和功能調控的載體[1]，精漿微環境直接影響精子質量和受精功能，精漿外泌體作為精漿成分中重要部分，具有膜結合特征的雙層磷脂結構，可攜帶并傳遞各種調控分子如蛋白質、信使RNA（mRNA）、微小RNA（miRNA）與脂質內容物等[2]，特殊的結構使其擁有信號運輸和調控等重要功能，近年研究發現精漿外泌體中信號傳遞通路對精子發生和運動能力獲得有重要調控作用[3～4]。因此本文就精漿外泌體的結構功能、提取方法以及在精子發生成熟、功能調控中的作用機制進行綜述。

1 精漿外泌體概述

外泌體是細胞分泌的一種類似于囊泡的納米級顆粒，外泌體中蘊含有多種機體代謝和生長所必須的重要物質，例如DNA、RNA和蛋白質等[5]，能實現信號傳遞以及調控功能，對機體的多種細胞信號傳輸做介導，因此在很多疾病上可利用外泌體作為診斷指標[6]。在對癌癥研究的進展中，發現循環體液中的外泌體可作為癌癥診斷的分子標記，外泌體中含有一種miR-1910-3p血清能夠促進乳腺癌細胞的遷移和增殖，該血清與傳統腫瘤標志物CA153結合使用可增加乳腺癌診斷的敏感性[7]。在肝癌細胞研究上也發現肝癌的發生過程中外泌體可以通過內吞作用或者配體-受體結合來傳遞信息至靶細胞后發揮作用，是肝癌細胞增殖的重要部分[8]。因此對外泌體進行研究不僅對癌細胞意義重大，對整個機體細胞的活動都至關重要。

精漿外泌體是存在于精漿中的膜性囊泡，按分泌器官來源可以分為前列腺小體和附睪小體，它們主要由上皮細胞以頂漿分泌的形式進入精漿，是精漿微環境的重要組成部分，由于精子特殊的生理結構，胞質含量極少，缺乏體細胞具有的清除酶和細胞器，同時精子受精前基因組轉錄處于沉默狀態，因此精子發生與成熟對其微環境較為依賴。精漿外泌體發揮功能主要依靠其作為載體攜帶的特殊組分，包括蛋白質、核酸、脂質和離子等，精漿外泌體通過膜融合機制被精子攝取，在精子自身的成熟和功能調控中發揮作用。研究發現不育男性與正常男性精漿外泌體的相關miRNA表達譜存在顯著差異，表明某些關鍵miRNA可能介導了男性不育發生[9]。精漿外泌體作為載體運輸的piRNAs在生殖系統細胞中的轉錄、逆轉錄以及逆轉錄后的基因沉默中有重要作用，特別是在精子發生過程中，piRNAs扮演著信息傳遞的角色[10]。因此對精漿外泌體的研究有可能發現男性不育疾病發生的新機制，篩選的差異性功能因子有可能成為男性不育診斷的特異性指標。

2 精漿外泌體的提取方法

不同組織來源的外泌體提取方法不同，整體而言大致分為兩種，離心法和試劑盒提取法[11]。離心法常見的有密度梯度離心法、超速離心法、差速離心法。精漿外泌體提取與胞外囊泡提取相似，劉聰慧等[12]研究發現，利用差速離心法與密度梯度離心法能順利提取胞外囊泡，但可能提取后產物純度低。差速離心法主要原理為根據密度和粒子大小設置不同離心力，有差別離心后通過平衡沉降原理完成提純，但因為設置的范圍內涵蓋的粒子較廣，可能提取產物純度不高。密度梯度離心法應用在常見組織提純中，特別是針對細胞內的分子與大分子物質，一般分離分子密度介于1.1～1.9 g/mL之間，因此離心常用介質為蔗糖，但介質密度范圍過大，會造成濾過不純的結果。因早期外泌體提取方法有一定的誤差，提取物不純，有研究者開始使用納米級材料提取外泌體[13]，例如在血漿中提取外泌體，使用ExoQuick試劑盒提取外泌體，該方法提取到的外泌體蛋白質濃度是傳統密度梯度離心法的19倍以上。隨著研究的深入與發展，最近有研究者還嘗試了純化試劑盒提取法提取小鼠血清的外泌體[14]，此方法提取外泌體操作簡單快捷，并且不容易出錯，適合提取容量較大的樣本，提高研究效率。總結來說提取外泌體如試驗要求純度不高時可利用簡單快捷的傳統方法如超速離心法與密度梯度離心法，或者使用純化試劑盒提取法，但要求高時可利用納米級操作提取，并且不同方法提取的外泌體成分可能有所差異，因此未來研究要進一步優化精漿外泌體提取操作，以便對精漿外泌體調控作用原理以及機制進行深入研究。

3 精漿外泌體在精子發生中的作用

精漿外泌體在精子發生過程中起到信號傳遞的作用，對調節精子發生有重要影響。精子發生要經過許多器官的作用，還需要許多因素協同作用，而調節協同作用傳輸信號的關鍵物質就是精漿外泌體。精漿外泌體成分復雜，其來自附睪、前列腺還有精囊等[15]。外泌體是細胞間通訊的關鍵，能夠為細胞相互傳遞信號分子和物質建立橋梁，不僅如此，精漿外泌體還能在弱酸條件下（pH為5～7）與精子進行融合;當pH值過高時（pH>7）則基本不會進行融合[16]。前列腺液與精液的pH值在7.4左右，這證明精漿外泌體促進精子獲能和運動一般不發生在射精前，主要發生在射精后[17]。精漿外泌體還攜帶多種具有生物學功能的蛋白質，蛋白質組學研究發現人精漿外泌體中的蛋白質相對分子質量大且具有不同功能類別，包括酶、黏附分子、轉運和信號傳遞蛋白等，其對精子有多方面生物學作用[18]，醛酮還原酶家族1成員B1、磷脂酰乙醇胺結合蛋白、5型谷胱甘肽過氧化物酶、泛素和精子黏附分子-1等直接參與精子活力和受精能力獲得，在精子氧化損傷防護中起到作用，FRENETTE等[19]發現巨噬細胞移動抑制因子與附睪小體結合，當附睪小體與精子融合時進入精子，通過作用于精子鞭毛上游離的巰基基團，防止二硫鍵提前形成，移除結合于精子鞭毛上的鋅離子，進而改變精子活力，促進精子成熟。精漿外泌體中的mRNA和非編碼小RNA不僅是潛在的免疫調節分子，還具有遺傳性[20～21]。

4 精漿外泌體在精子功能調控中的作用

據統計目前育齡夫婦不孕不育癥的發生率為15%～20%，其中男性因素約占50%[22～23]，精子功能是保證正常受精的關鍵，精子活力及功能異常是導致男性不育的重要原因[24～25]。我們前期研究證實精子功能障礙常呈多因素并發[26～27]，精子活力低下多與精子形態異常、精子DNA碎片率升高、頂體功能障礙等并發，顯著影響精子正常受精功能，是導致男性不育的重要誘因，同時也是導致輔助生殖助孕周期受精失敗、胚胎發育異常、早期流產等治療結局差的重要原因[28]。精漿外泌體作為精漿微環境的重要組成部分，既參與精子發生，又在調節成熟精子功能中起到重要作用。有研究認為精漿外泌體具有免疫抑制效應，促進精液液化，同時精漿外泌體含有豐富的膽固醇、鈣離子和表面膜蛋白，與精子融合之后能夠促進精子活力、頂體反應發生[29]。同時精漿外泌體在精子活力調控中也具有重要作用，SULLIVAN等[30]發現精子在附睪的成熟過程中，外泌體是產生具有最佳受精能力的雄性配子所必須的，MURDICA等[10]的研究顯示，精漿中外泌體可以通過增加誘導酪氨酸磷酸化來促進精子獲能，從而引發頂體反應。DU等[31]的研究通過添加不同比例的公豬精漿外泌體證實外泌體可以提高體外儲存精子活力，延長精子保存期限，改善精子質膜完整性，增加抗氧化能力。因此我們推測，精漿外泌體對精子功能調控具有重大影響，其中還有許多調控通路與機制值得進行深入研究。

5 小結與展望

精漿外泌體在精漿中廣泛存在，其作為精子生存的重要生理微環境，在精子成熟及活力調控中起到至關重要作用，精漿外泌體功能及作用機制研究已成為男性不育研究中全新熱點領域，但目前精漿外泌體調控精子活力及運動的具體機制仍未完全闡明，因此開展相關研究非常有必要。尤其基于現在多組學聯合分析技術的發展，針對男性不育患者精漿外泌體進行全蛋白組、全轉錄組的系統研究，繪制出不育男性精漿外泌體蛋白質組、轉錄組的全景圖及其與正常男性的動態差異圖，從疾病整體角度進行聯合分析，進而挖掘出在精子發生與功能調控過程中的關鍵蛋白及關鍵基因表達調控通路，將有助于闡明男性不育發生的分子機理，有可能提供精漿外泌體中關鍵因子影響精子發生與功能的直接證據，揭示精漿外泌體調控精子功能的具體機制，為男性不育的診斷提供新的診斷指標，為男性不育臨床治療提供新的途徑。

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（收稿日期：2021-08-18 修回日期：2021-09-01）

（編輯：潘明志）