青海省BYDV株系鑒定及BYDV-GAV燕麥分離物基因組序列的測定與分析

喬世英，季英華，魏有海，閆佳會，郭青云

(1.青海大學農林科學院/青海省農業有害生物綜合治理重點試驗室/農業農村部西寧作物有害生物科學觀測試驗站，青海西寧 810016； 2.江蘇省農業科學院植物保護研究所/江蘇省食品質量安全重點試驗室-省部共建國家重點試驗室培養基地，江蘇南京 210014)

大麥黃矮病毒(barley yellow dwarf virus，BYDV)引起的小麥黃矮病是一種全球范圍內的麥類作物病害，該病害最早在美國的加利福尼亞州被發現并報道[1]，此后陸續在土耳其[2]、法國[3]、巴西[4]、巴基斯坦[5]等地流行并報道。我國小麥黃矮病最早發生于20世紀六七十年代，在主要的糧食作物種植區均有大面積流行，對我國糧食生產造成嚴重損失。近幾年，小麥黃矮病在全國范圍內的流行發生趨勢減弱，但在青海省的小麥產區仍有較大面積的發生[6-7]。

BYDV為黃癥病毒科(Luteovidae)單鏈RNA病毒，基因組全長約 5.7 kb，蚜蟲是其主要的傳毒介體[8-9]。該病毒侵染小麥后，植株變矮，葉片由葉尖至葉柄處逐漸變黃，在小麥抽穗期會產生不抽穗或穗發育不良的癥狀[10-12]；燕麥被侵染后會出現紅葉病，在染病后期被侵染葉片褪綠變紅，相對于健康葉片有明顯的增厚，危害嚴重時，葉片后期褪綠變為紫色[13-14]。BYDV株系的劃分主要依據其蚜蟲的傳播?；裕趪H分類上，BYDV株系可劃分BYDV-RPV、BYDV-RMV、BYDV-SGV、BYDV-PAV和BYDV-MAV 5個株系；國內學者將BYDV株系劃分為BYDV-GAV、BYDV-GPV、BYDV-PAV和BYDV-RMV 4個株系，其中，BYDV-RPV株系由禾谷縊管蚜(Rpopalosiphumpadi)傳播，BYDV-RMV株系由玉米蚜(R.maidis)傳播，BYDV-SGV株系由麥二叉蚜(Schizaphisguaminum)傳播，BYDV-PAV株系由禾谷縊管蚜和麥長管蚜(Sitobionavenae)傳播，BYDV-MAV株系由麥長管蚜傳播，BYDV-GAV株系由麥二叉蚜和麥長管蚜傳播，BYDV-GPV株系由麥二叉蚜和禾谷縊管蚜傳播[15-16]，其中BYDV-GAV為我國流行株系，BYDV-GPV為我國特有株系[17]。

小麥、青稞、燕麥[18]是青海省的主要麥類種植作物，近年來黃矮病不斷發生，對我省作物生產造成嚴重損失。翟 浩等[12]對青海省西寧市、互助縣、樂都縣及貴德縣小麥田間疑似黃矮病樣品進行相關研究，發現BYDV-GAV為青海省小麥黃矮病的主要流行株系。李廷芳等[19]研究發現，青海省青稞分離物與BYDV-GAV渭南小麥分離物親緣關系較近，是中國BYDV-GAV的一個分離物。但目前有關整個青海省主要糧食作物種植區BYDV流行株系尚未見報道，且青海省燕麥BYDV-GAV株系全基因組也未見相關報道。因此，本研究以采集到的90份全省糧食作物種植區田間疑似黃矮病樣品為試驗對象，采樣地點覆蓋到各州縣，避免局部地區采樣的弊端，對所有采集樣品進行RT-PCR檢測，明確青海省BYDV的流行株系，并通過分子克隆技術獲得燕麥BYDV-GAV全基因組序列，全面闡述了青海省小麥黃矮病的發生情況、流行株系分布等，以期為后期小麥黃矮病抗病品種的選育及病害防治工作奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

于2019年7月至9月在青海省各州縣采集田間小麥(53份)、青稞(12份)、燕麥(25份)黃矮病疑似樣品共90份，分別采自西寧市(13份)、海東市(25份)、海西州(23份)、海南州(21份)、黃南州(4份)和玉樹州(4份)。樣品采集后立即凍存于液氮罐中，帶回試驗室存于-80 ℃冰箱。

1.2 引物的設計與合成

利用NCBI網站與軟件Primer Primer 5設計本試驗所需的檢測引物與全基因組擴增引物，引物序列信息見表1。

表1 本研究用到的引物信息

1.3 試驗方法

1.3.1 RNA的提取

取待測樣品50～100 mg，采用Trizol法提取總RNA，提取的RNA用25 μL的RNase Free ddH2O進行溶解并保存于 -80 ℃冰箱中。

1.3.2 RT-PCR檢測

采用PrimeScriptTMRT Master Mix反轉錄試劑盒(寶生物工程有限公司)進行RNA反轉錄，反應體系為20 μL，包括RNA 1 μL，PrimeScriptTMRT Master Mix 4 μL，RNase Free ddH2O補足到20 μL，反應程序：37 ℃ 15 min， 85 ℃ 5 s，反應終止后將樣品迅速置于冰上，并保存于-20 ℃冰箱中。以合成的cDNA為模板進行PCR檢測，反應體系為20 μL，包括cDNA 1 μL，2×Taq Master Mix(南京諾唯贊生物科技有限公司) 10 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1)各 1 μL，RNase Free ddH2O補足至20 μL。PCR反應程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，退火45 s(各引物退火溫度見表1)，72 ℃ 3.5 min，35個循環； 72 ℃ 10 min，反應結束后4 ℃保存。取5 μL反應產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.3 燕麥BYDV-GAV全基因組序列的克隆

反轉錄過程采用反轉錄試劑盒(大連寶日醫生物技術有限公司)進行一系列試驗操作。PCR反應體系為25 μL，包括cDNA 1 μL，2×Phata Max Buffer(南京諾唯贊生物科技有限公司)12.5 μL，Phata Max Super-Fidelity DNA Polymerase 0.5 μL，dNTP Mix(10 mmol·L-1)0.5 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL，ddH2O補足至25 μL。PCR反應程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 3.5 min，共35個循環； 72 ℃補充延伸10 min，反應結束后4 ℃保存。取 3 μL PCR產物與5×Loading buffer混合后進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。選取較亮的目的條帶，利用Axygen公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒進行目的片段回收，回收產物連接至pEASY-Blunt Zero克隆載體(北京全式金生物技術有限公司)，熱擊法轉入大腸桿菌Trans-T1感受態細胞(北京全式金生物技術有限公司)中，選取陽性克隆 送測。

1.3.4 序列分析

利用DNAStar軟件進行序列比對及拼接等，所得基因組序列通過NCBI網站(http://www.ncbi.n/m.nih.gov/BLAST/Blast.cgi)進行BLAST比對，利用MEGA 6.0軟件構建系統進化樹。

2 結果與分析

2.1 田間植株癥狀

田間植株感染BYDVS后癥狀主要表現為植株明顯變矮、葉黃化等癥狀。小麥上的癥狀一般為植株葉片從葉尖開始變黃，葉片顯現黃綠相間條紋，植株變矮，叢枝等；燕麥感染BYDV后表現為燕麥紅葉病，植株葉片明顯變紅增厚，危害嚴重時葉尖完全褪綠枯死，下部葉片呈紫紅色；青稞受BYDV侵染后，主要表現為葉片出現黃綠相間的條紋，植株明顯變矮(圖1)。

圖1 青海省小麥、燕麥和青稞田間病害癥狀

2.2 RT-PCR檢測結果

利用引物GAV-F/R、PAVL1/R1、MAVL1/R1、SGVL2/R2、RMVL1/R1、RPVL/R對所有黃矮病疑似樣品進行RT-PCR檢測，結果(圖2)發現，部分樣品利用引物GAV-F/R、RPVL/R、MAVL1/R1、SGVL2/R2和PAVL1/R1擴增可分別得到約600、400、200、250和250 bp的目的條帶。PCR檢測結果顯示，部分樣品存在病毒株系復合侵染的現象，除能檢測到BYDV-GAV株系外，還能檢測到其他株系。如在小麥樣品中，19QGW2、19QJW2、19QJW3同時檢測到BYDV-GAV和BYDV-MAV株系，19QJW4同時檢測到BYDV-GAV和BYDV-RPV株系，19QHW2、19QXW1、19QAW3同時檢測到BYDV-MAV、BYDV-GAV和BYDV-RPV株系，19QRW4同時檢測到BYDV-GAV、BYDV-RPV和BYDV-PAV株系；在燕麥樣品中，19QGO2同時檢測到BYDV-MAV、BYDV-GAV和BYDV-RPV株系，19QLO1、19QPO1、19QBO1、19QDO2同時檢測到與BYDV-MAV和BYDV-GAV株系，19QDO1同時檢測到BYDV-GAV和BYDV-SGV株系；在青稞樣品中，19QNB1、19QPB1同時能檢測到BYDV-MAV和BYDV-GAV株系。

A：引物GAV-F/R的部分樣品擴增結果；B：引物RPVL/R的部分樣品擴增結果；C：引物MAVL1/R1的部分樣品擴增結果；D：引物SGVL2/R2的部分樣品擴增結果；E：引物PAVL1/R1的部分樣品擴增結果。Maker：DL5000；其他泳道為供試材料在采集樣品中的代號，其中19代表采集年份2019，第一個字母Q代表青海省，第二個字母代表采樣地點(G表示貴德縣，D表示都蘭縣，N表示貴南縣，P表示共和縣，L表示樂都縣，J表示尖扎縣，H表示化隆縣，X表示循化縣，A表示平安縣，M表示民和縣，R表示湟中縣，B表示德令哈市，Z表示互助縣，T表示大通縣)，第三個字母代表寄主(W為小麥，O為燕麥，B為青稞)，CK1～CK3分別代表健康小麥、燕麥、青稞 植株。

2.3 不同寄主、地區BYDV株系的分布情況

檢測結果(表2)顯示，BYDV-GAV為青海省主要流行株系，檢出率為90.0%，其他株系檢出率表現為BYDV-MAV(51.1%)>BYDV-RPV(7.8%)>BYDV-PAV(6.7%)=SGV (6.7%)。采集樣品感染BYDV的植株中，小麥占主要部分，其他依次為燕麥、青稞。從株系看，BYDV-GAV株系在小麥和燕麥樣品中檢出率較高，分別為 92.5%和92.0%，BYDV-PAV株系在青稞中檢出率最高，為16.7%；BYDV-MAV株系在小麥中檢出率較高，為58.5%；BYDV-RPV株系在小麥中檢出率最高，為9.4%；BYDV-SGV株系在小麥中檢出率最高，為9.4%，但其在青稞樣品中未被檢測到。方差分析結果顯示，不同寄主不同株系間無顯著差異。少量樣品中也檢測到BYDV-GPV株系的侵染，后期對該株系進行了進一步的克隆與驗證(待發表)。

表2 不同寄主感染BYDV的檢測結果

從表3可以看出，BYDV-GAV株系在西寧市、海東市、黃南州樣品中檢出率較高，均超過90%，其他依次為玉樹州、海西州、海南州，均超過60%；BYDV-PAV株系在西寧市、海東市、黃南州、玉樹州樣品中均檢測到，但所占比例較小，在海南州和海西州未檢測到BYDV-PAV株系；BYV-MAV株系在西寧市、海東市、海南州、黃南州樣品中檢出率都為50%左右，但海西州檢出率較低，為26.1%，玉樹州樣品中未檢測到該株系；BYDV-RPV株系只在西寧市、海東市、黃南州樣品中檢測到，且所占比例較小，在海南州、海西州、玉樹州樣品中未檢測到該株系；BYDV-SGV株系在西寧市、海東市、海南州、海西州均檢測到，但該株系所檢測到的樣品數極少，且在黃南州和玉樹州樣品中未檢測到該株系。經方差分析，不同地區不同株系間無顯著差異。

表3 青海省各市(州)小麥黃矮病株系的分布

2.4 青海省BYDV-GAV燕麥分離物的分子鑒定結果及全基因序列分析

2.4.1 BYDV-GAV燕麥分離物分子鑒定結果

利用設計的BYDV-GAV 特異性引物 GAV-F/R對采集到的25份燕麥樣品進行RT-PCR檢測，結果(圖3)發現，部分燕麥樣品擴增到大小約600 bp的條帶，與目的條帶(600 bp)大小一致。

Maker：DL 5000 marker；CK：健康燕麥植株；19QGO1～19QTO1：燕麥樣品，字母代表含義詳見圖2。

2.4.2 BYDV-GAV燕麥分離物全基因組克隆及序列分析

為進一步確定病毒株系，選取其中一個燕麥樣品(19QPO3)進行BYDV-GAV的全基因組克隆。根據BYDV-GAV(EU402390)基因組序列特征，分段設計引物BYD-1sbF/BYD-1R和BYD-2bsF/BYD-2xmR克隆青海省BYDV-GAV燕麥分離物全基因組序列(圖4)。以典型樣品19QPO3總RNA為模板，利用RT-PCR技術進行擴增，得到2.8 kb左右的目的條帶(圖5)。

圖4 BYDV-GAV分段擴增策略

圖5 用引物BYDV-1bsF/1R和BYDV-2bsF/2xmR擴增出的條帶

應用DNAStar軟件對測序結果進行比對與序列拼接，發現19QPO3的基因組全長為5 685 bp，包括6個開放閱讀框和4個非編碼區。對19QPO3進行BLAST分析可知，其與中國的BYDV-GAV序列同源性較高(96.85%～ 98.08%)(表4)。系統進化分析(圖6)可以看出，19QPO3聚類到中國BYDV-GAV小麥分離物的分支上。綜合上述結果可得，本試驗所得燕麥分離物為中國BYDV-GAV的一個分離物。

各枝上的數字是1 000次Bootstrap自導復制的置信度?！瘢罕驹囼灉y定的青海省燕麥分離物；○：之前報道的青海省青稞分離物。

表4 聚類分析中所涉及的序列信息

在系統進化關系上，BYDV-GAV分為三個組，中國的BYDV-GAV分離物聚類到兩個組內，其中陜西渭南的三個分離物(登錄號：EU402389、EU402388和EU402390)、楊凌的兩個分離物(登錄號：EU402386和KF523380)、陜西扶風的一個分離物(登錄號：KF523381)與中國的其他三個分離物(登錄號：AY220739、AY610953和AY610954)共同聚類到一個組上(Cluster I)。陜西鳳翔的一個分離物(登錄號：EU402387)、渭南的兩個分離物(登錄號：EU402391和KF523379)、安康的一個分離物(登錄號：KF523378)和甘肅天水的一個分離物(登錄號：KF523382)共同聚類到一個組上(Cluster II)。愛沙尼亞的兩個分離物(登錄號：MK012662和MK012663)聚類到一個組上(Cluster III)。其中，本試驗所得燕麥分離物19QPO3聚類到第一組內，與陜西楊凌的兩個分離物親緣關系較近，同源性較高，分別為97.82%和97.94%，與之前在青海省所得的青稞分離物聚類到不同小支上[19]，同源性相對較遠。

3 討 論

小麥在世界糧食作物中占據重要地位，在我國的麥類糧食作物中亦占據著重要地位[20]。近年來，有學者發現，造成小麥病毒病害的病原主要有大麥黃矮病毒(BYDV)，小麥矮縮病毒(WDV)、小麥條紋花葉病毒(WSMV)等[21-22]。晉治波[23]通過試驗得到中國BYDV-GAV基因組全序列，并進行相關序列分析，結果表明，該病毒株系包含6個開放閱讀框，編碼4個主要蛋白。

青海省地處青藏高原，地理位置較為特殊，主要種植小麥、燕麥和青稞，本試驗采集了青海省6個州市的田間小麥黃矮病疑似病樣進行RT-PCR檢測。病樣的采集結果因青海省種植區域分布的不同存在一定的差異。檢測結果表明，青海省小麥黃矮病株系的分布不管是從寄主區分還是從地理環境區分，其主要流行株系均為BYDV-GAV株系，與劉 楠等[24]、翟 浩等[12]的檢測鑒定結果相一致。試驗結果也顯示，所采集樣品除存在BYDV-GAV株系與其他株系復合侵染的現象外，也存在少量的BYDV-PAV、BYDV-SGV株系的復合侵染現象，對于這一結果的產生還需進行進一步的驗證。此次試驗病樣的采樣地點分布于整個青海省，部分采樣點間海拔跨度較大，地理環境相差較大，植株所處生長期不同，發病時期不一致，這些因素對于檢測結果都存在一定的影響。

通過本試驗所得的燕麥分離物19QPO3與已報道的BYDV-GAV分離物構建系統進化樹，并進行聚類分析，結果表明，19QPO3與已報道的中國BYDV-GAV分離物聚類到一個分支上，說明19QPO3為中國BYDV-GAV的一個分離物，且與陜西楊凌小麥分離物(登錄號：KF523380)親緣關系相對較近。系統進化樹分析可見，本試驗所得的BYDV-GAV燕麥分離物19QPO3與之前得到的青海青稞分離物14Qh8-1[19]雖共同聚類到一個組內，但分布在不同支上，且親緣關系較遠，產生此結果的原因可能是寄主基因突變、地理環境等因素的影響，但還需進一步試驗驗證。

近年來，青海省小麥黃矮病的發生呈現日漸嚴重的趨勢，因此對于該病害的研究具有一定的科學意義。研究并確定青海省小麥黃矮病的主要流行株系，可更好地了解小麥黃矮病在青海省內的發生流行趨勢，為該病害的防治提供一定的理論參考。本試驗獲得的青海省BYDV-GAV燕麥分離物的基因組全長序列為后期試驗的進行提供部分參考依據，也為進一步探究該病害在青海省內的發生流行趨勢及該病害的進化變異規律提供一定的理論基礎。