牙髓血運重建對大鼠年輕恒牙影像及VEGF、NGF的影響

劉迪 史濱偉 陶冠男

目前，臨床上對于年輕恒牙的治療除了需要進行根管治療外，亦需要促進根尖孔閉合治療，包括：氫氧化鈣根尖誘導成形術即MTA根尖屏障術等[1]。而牙髓血運重建術屬于一種新型的干預方法，治療過程中經嚴格的根管消毒、刺激根尖周血液進入根管及嚴密冠部填充，能使得牙根繼續發育，影像學下多表現為牙根長度提高、根管壁增厚及根尖病變消失等[2]。同時，牙髓血運重建術的使用能使得根管中有血管化生長組織長入，能鞏固手術效果。但是，牙髓血運重建術對血管內皮細胞生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、神 經 生 長 因 子（nerve growth factor，NGF）的影響研究較少。本研究以大鼠為對象，探討牙髓血運重建術在年輕恒牙大鼠中的作用機制，報道如下。

1 資料與方法

1.1 動物資料

購置3周齡大鼠20只，隨機10只大鼠設為對照組，體質量60～80 g，平均（70.00±10.00）g；剩余大鼠建立大鼠年輕恒牙牙髓血運重建術的模型，設為觀察組，術后3周后處死實驗動物。20只大鼠均為體質量60～80 g的SPF級SD大鼠，平均（72.00±8.00）g；雌雄各半（動物合格證號：SCXX-2005-0001），所選動物均購置于實驗動物房，完成大鼠的常規喂養、光照。兩組一般資料差異無統計意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 儀器與設備

實驗所用的儀器與設備見表1。

表1 儀器與設備

1.3 方法

建模方法為：（1）建模前準備。納入研究的20只大鼠中的隨機10只大鼠設為對照組；剩余大鼠建立大鼠年輕恒牙牙髓血運重建術的模型，設為觀察組，術后3周后處死實驗動物，具體建模方法如下：建模大鼠均完成腹腔麻醉，麻醉誘導時間為5～10 min；待實驗翻正反射消失后，將其固定在大鼠專用的固定與口腔牽拉裝置，根據建模需要，調節裝置的角度，充分暴露大鼠口腔手術區域、下頜磨牙區域，并將其放置在手術區域，以獲得清晰的手術視野；（2）年輕恒牙牙髓血運重建術[3]。手術前對大鼠進行常規消毒，待麻醉生效后進行鋪巾；將大鼠放置小棉卷隔濕，對大鼠所有操作均嚴格遵循無菌操作；借助高速不銹鋼球鉆從大鼠下頜第一磨牙的管部完成開髓，借助生理鹽水常規完成根管腔的沖洗，并將K銼進行處理干預，保證K銼高于根尖孔，刺激根尖組織出血并達到根管口水平部位，待血塊凝結后，借助MTA完成凝血塊面的覆蓋；利用玻璃水門汀（GIC）完成冠部充填[4]。術后3周后處死實驗動物，并完成下頜骨分離，并完成組織學、影像學觀察。

1.4 觀察指標

（1）影像學觀察。兩組干預完畢后使用X線成像系統對標本逐個進行斷層掃描成像；（2）測定VEGF、NGF mRNA。步驟為：①取上述分離的組織標本，向標本中加入Trizol 500 μL，充分混合后轉移到離心管1.0 mL，5 min振蕩后，靜置。向各組標本中加入氯仿200 μL 15 s振蕩，5 min靜置后15 min離心，離心速度12 000 rpm；完畢后加入預冷的乙醇（濃度75.0%）1 mL，常溫下7 min干燥；經紫外分光度儀A260下測定吸光度值。②檢測方法：采用實時熒光PCR法測定兩組VEGF、NGF mRNA水平。根據實驗需要完成PCR參數設置：30℃下10 min；42℃下30 min；99℃下5 min；5℃下5 min，合計完成循環35個，72℃下10 min延長，獲得最終產物并放入1.5%瓊脂凝膠電泳，β-actin為內對照，引物見表2。

表2 引物設計

1.5 統計學方法

采用SPSS 18.0軟件處理，計數資料行χ2檢驗，用例（%）表示，計量資料行t檢驗，采用 （±s）表示，P＜0.05時表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組影像學結果比較

X線成像系統結果表明：觀察組牙髓血運重建組大鼠下頜第一磨牙牙根尖部陰影膨大，管壁增厚，有新生高密度硬組織形成，牙根繼續發育。對照組大鼠下頜第一磨牙牙體完整，根尖周圍未見明顯異常，牙根發育尚未完成，根管口成喇叭狀，見圖1。

圖1 兩組X線結果比較

2.2 兩組VEGF、NGF mRNA比較

實時熒光PCR法結果表明：觀察組大鼠牙髓血運重建術干預后VEGF、NGF mRNA水平明顯高于對照組（P＜0.05），見表3。

表3 兩組VEGF、NGF mRNA比較（OD， ±s）

表3 兩組VEGF、NGF mRNA比較（OD， ±s）

組別 例數 VEGF mRNA NGF mRNA觀察組 10 3.43±0.51 1.36±0.34對照組 10 1.02±0.25 0.95±0.16 t值 - 12.418 3.450 P值 - 0.000 0.003

3 討論

牙髓損傷修復過程中，血管生成是牙本質成功修復的前提，而血管內皮生長因子在其中發揮了重要的作用。既往研究表明[5]：人牙本質基質及牙髓組織中VEGF含量相對較少，其分泌細胞為牙髓成纖維細胞、牙本質樣細胞與未分化間質細胞與巨噬細胞等。國外學者研究表明[5-7]：VEGF能強烈誘導人牙髓細胞的趨化性能，能促進細胞的增殖與分化。而NGF是在人體中發現的一種對正常神經細胞有營養作用，對損傷神經修復機能具有良好的調節作用的生長因子，能維持交感神經與感覺神經的生存，亦可促進神經細胞的分化，其表達水平決定軸突的伸展方向，對促進大腦發育、神經系統的生長與損傷神經的再生具有良好的促進作用。既往研究表明：NGF廣泛用于神經中毒、周圍神經損傷、糖尿病性周圍神經病變等疾病中，屬于目前唯一能用于臨床的神經系統蛋白因子。牙髓血運重建術屬于是一種微創干預方法，最早由國外學者于2001年首次提出，并用于牙髓再生患者中，但是在年輕恒牙中

的作用研究較少。本研究中，X線成像系統結果表明：觀察組牙髓血運重建組大鼠下頜第一磨牙牙根尖部陰影膨大，管壁增厚，有新生高密度硬組織形成，牙根繼續發育。對照組大鼠下頜第一磨牙牙體完整，根尖周圍未見明顯異常，牙根發育尚未完成，根管口成喇叭狀，提示牙髓血運重建術能促進年輕恒牙的治療、修復，能獲得良好的預后。牙髓血運重建術是指恒牙治療過程中，嚴格的根管消毒、刺激根尖周血液進入根管與嚴密冠部充填，能促進牙根繼續發育，從而引起根管壁增厚、根尖孔逐漸閉合及根尖病變消失。因此，牙髓血運重建術用于年輕恒牙中，能促進血管化組織長入，能提高VEGF、NGF水平及數量[8-10]。國內學者研究表明[11]：VEGF、NGF均具有促進血管新生的作用，亦可促進細胞趨化，且VEGF能促進細胞有絲分裂；而NGF利于神經細胞的存活和生長。本研究中，實時熒光PCR法結果表明：觀察組大鼠牙髓血運重建術干預后VEGF、NGF mRNA水平高于對照組（P＜0.05），提示牙髓血運重建術能提高VEGF、NGF mRNA水平，能評估大鼠預后，可指導年輕恒牙的治療。因此，年輕恒牙治療過程中應加強VEGF、NGF水平測定，評估預后，但是本研究尚處于動物實驗結果，臨床使用尚需要進一步研究與探討[12-13]。

綜上所述，牙髓血運重建術用于年輕恒牙大鼠中效果理想，能提高VEGF、NGF水平，可為臨床治療提供參考依據。