基于體外藥效學結合網絡藥理學和分子對接對人參-桑椹改善骨質疏松的機制研究

劉 玲，李春楠，蘭 夢，吳孟雅，張 輝, ，邊學峰,

（1.長春中醫藥大學，吉林省人參科學研究院，吉林長春 130117；2.吉林省東北亞生物科技有限公司，吉林長春 130117）

骨質疏松癥（osteoporosis，OP）以骨代謝紊亂、微結構損壞為主要特征，并且由于骨量流失及強度降低，日后容易并發主要部位的脆性骨折[1]。OP的發病率隨著人口老齡化的加重而逐年上升。現已經成為世界上第七大最常見的疾病[2]。研究顯示，中藥及其復方具有整體調節作用，調節激素水平，提高機體免疫力，促進骨密度增加，改善和修復受損的小梁骨微結構，治療OP患者的疾病[3?4]。中藥及其復方在預防和治療OP方面具有較高的安全性和獨特的優勢，但其具體作用機制尚不清楚。隨著網絡藥理學的發展和應用，從靶向生物信號網絡的角度進行深入分析，對中醫藥防治OP具有重要意義。

人參為五加科植物（Panax ginsengC. A. Mey）。2020版藥典記載，其具有大補元氣，強精補腎之功效。桑椹為桑科植物桑（Morus albaL.）的干燥果穗，2015版藥典記載歸心、肝、腎精，具有治療肝腎陰虛，關節不利之功效。腎虛是骨質疏松癥的主要病因，而腎精的升降決定了骨的強弱，因此補腎中藥被廣泛應用于骨質疏松癥的防治[5]。中醫認為，腎藏精，精生髓，髓養骨。從生理上講，腎臟儲蓄先天的精華，可以轉化為骨髓。骨髓儲存在骨頭里，骨髓充實則骨骼生長強硬；病理上，腎精虧虛，骨髓不足，骨質流失，導致各種骨病。近年來，大量研究表明人參、桑椹都具有改善骨質疏松的作用，但目前研究主要集中于單味藥的藥性，二者聯合用藥后改善骨質疏松的研究未見報道，且人參、桑椹藥食同源，對于食品開發的研究具有廣闊前景，相比于西藥治療毒副作用小。

網絡藥理學自2008年發出以來[6]，其成為一門新興學科，在調控水平上揭示了中藥在人體調節網絡中的作用。由于其整體性，系統性的研究方法以及藥物與中藥的多靶點，多病理特征共同作用的特點，已成為系統分析多靶點，多路徑機制的有效工具[7]。多項研究利用網絡藥理學探索中藥作用機制已經取得成功[8?9]。

本實驗主要通過人參水提液（GW）、桑椹水提液（MW）、人參醇提液（GC）、桑椹醇提液（MC）、人參和桑椹水提物配伍（GMW）、人參和桑椹醇提物配伍（GMC）六個試驗組及以H2O2溶液組為睪丸間質細胞實驗對照組，地塞米松為成骨細胞分化實驗對照組，采用細胞實驗并結合網絡藥理學方法，探究人參、桑椹單味藥與藥對水提物及醇提物治療骨質疏松作用的效果及其分子機制，為其后續開發應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小鼠睪丸間質細胞TM3、小鼠成骨細胞MC3T3-E1 中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞資源中心；人參、桑椹 共二味藥材，吉林敖東世航藥業，經長春中醫藥大學張輝教授鑒定，均為《中國藥典》2020年版收載品種；胎牛血清 美國Gibco公司；胰蛋白酶、噻唑藍（MTT） 美國Amresco公司；MEM細胞培養液、雙抗（100 μg/mL的鏈霉素和100 U/mL的青霉素） 美國Hyclone公司；二甲基亞砜 天津市光復精細化工研究所；小鼠睪酮（T）酶聯免疫吸附檢測試劑盒 美國Rad公司；地塞米松索萊寶；BCA法蛋白定量試劑盒 中國碧云天；堿性磷酸酶（ALP）試劑盒 中國南京建成。

BSA124S-CW電子天平 德國Sartorius；KS-5200DB型清洗器 昆山潔力美超聲儀器有限公司；Microfuge.22RCentrifuge型高速低溫離心機 美國Beckman Coulter公司；BIO Memory ?86 ℃超低溫冰箱 法國Froilabo公司；YZ-875超凈工作臺 蘇州凈化設備廠；多規格培養皿 美國Corning公司；HERAEUS HERA cell 150二氧化碳培養箱 日本三洋公司；Milli-Q超純水儀 美國Bedford公司；Mode1680型酶標儀 日本Takara公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備 人參、桑椹單味藥及藥對1:1比例加入10倍量水，浸泡0.5 h，提取2次，每次提取1 h，合并2次濾液，得到人參水提液（GW）、桑椹水提液（MW）、人參和桑椹水提物配伍（GMW）藥液。再將人參、桑椹單味藥及藥對1:1比例加入8倍量乙醇，浸泡0.5 h，提取2次，每次提取2 h，合并2次濾液，得到人參醇提液（GC）、桑椹醇提液（MC）、人參和桑椹醇提物配伍（GMC）藥液。將六種樣品分別減壓濃縮再進行烘干制成干膏，置4 ℃冰箱保存待用。

1.2.2 細胞培養 凍存的MC3T3-E1細胞和TM3細胞復蘇后，在37 ℃恒溫條件下，5% CO2培養箱中培養含10%胎牛血清和MEM培養基的細胞。當細胞貼壁后，取出培養基，用PBS洗滌三次，直至無漂浮細胞。再次加入培養基繼續培養。當細胞被80%~90%覆蓋時，用0.25%胰蛋白酶傳代，每2~3 d傳代一次。取對數生長期細胞用于實驗。

1.2.3 單味藥及藥對不同組分對TM3細胞增殖率和睪酮分泌的影響 實驗分為給藥組GW、MW、GC、MC、GMW、GMC，模型組（MS）和空白組（Control）。將給藥組成分溶于少量二甲基亞砜中，用培養基稀釋成12.5、25、50、100、200 μg/mL，對照組加入相同體積的培養基。將TM3細胞接種于96孔板中，每孔加入200 μL細胞懸液（4×103細胞/孔），每組5復孔。培養24 h后，棄去培養基，分別加入12.5、25、50、100、200 μg/mL濃度樣品，對照組加入3.125 μmol/L的H2O2溶液。培養24 h后，收集細胞上清進行睪酮檢測。每孔加入MTT（5 mg/mL），37 ℃暗孵4 h，于490 nm處檢測，根據吸光度計算各組細胞增殖率和睪酮分泌量。

1.2.4 MC3T3-E1細胞增殖試驗 MC3T3-E1細胞接種于96孔板中，24 h后加入不同濃度的樣品，使各組的終濃度分別為12.5、25、50、100、200 μg/mL。每組5個復孔。將其置于37 ℃的5% CO2培養箱中連續培養。24 h后，每孔加入MTT（5 mg/mL）試劑，37 ℃暗孵4 h。根據測定的吸光度，計算各組細胞增殖率。

1.2.5 MC3T3-E1細胞分化試驗 用ELISA法檢測細胞ALP活力。以加入地塞米松（100 μmol/L）作為模型組（MS），以12.5、25、50、100、200 μg/mL濃度的GMW和GMC作為給藥組，MC3T3-E1細胞為空白組。將細胞轉移到12孔板并培養24 h后加入不同濃度的樣品，使各組的終濃度分別為12.5、25、50、100、200 μg/mL。24 h后，進行檢測。具體方法按照BCA法蛋白定量試劑盒說明及ALP試劑盒說明操作進行測定。

1.3 網絡藥理學分析

1.3.1 人參-桑椹成分篩選、靶點預測及網絡構建在TCMSP[10]（http://tcmspw.com/tcmsp.php）數據庫以“人參”、“桑椹”、“RenShen”、“SangShen”為關鍵詞，收集人參-桑椹中化學成分，并以口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）及類藥性（Drug-likeness，DL）的篩選條件（OB≥30%，DL≥0.18）[11]進行篩選作為吸收、分布、代謝、排泄參數篩選出符合條件的化學成分作為活性成分并得到相關靶點，借助疾病靶點標準化數據庫（Universal protein，UniProt）（https://www.uniprot.org/）查詢相關靶點對應的基因名，并利用Cytoscape3.7.0軟件構建成分-靶點網絡圖，并對網絡拓撲參數進行了分析，確定關鍵節點，分析人參-桑椹改善骨質疏松癥的物質基礎。

1.3.2 骨質疏松癥靶點收集 應用GeneCards數據庫（https://www.genecards.org/）OMIM數據庫（https://www.omim.org/）輸入關鍵詞“Osteoporosis”收集骨質疏松癥相關靶點，并通過Uniprot（http://www.uniprot.org/）數據庫將靶點轉換為Uniprot Entry格式。應用Venny 2.1在線軟件作圖工具平臺（http://www.Venn.org/）將活性成分作用靶點與骨質疏松癥相關靶點取交集，得到人參-桑椹藥對治療骨質疏松癥關鍵靶點。

1.3.3 關鍵靶點蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡構建 將關鍵靶點導入蛋白質相互作用分析數據庫STRING（https://string-db.org/），選擇“Homo sapiens”，設定置信度≥0.400，分析關鍵靶點的相互作用，并將收集的數據導入Cytoscape3.7.0軟件構建PPI網絡。

1.3.4 GO功能富集和KEGG通路富集 為探索關鍵靶點的生物功能和作用通路，將關鍵靶點輸入到DAVID數據庫[12]（https://david.ncifcrf.gov/），進行GO（Gene Ontology，基因本體）和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，京都基因與基因組百科全書）分析，并以P<0.05為條件進行篩選，選取基因數目排名前20的通路，利用imageGP（http://www.ehbio.com /ImageGP/）工具繪制氣泡圖。利用Cytoscape3.7.0軟件構建“成分-靶點-通路”網絡圖。

1.3.5 分子對接驗證 通過檢索TCMSP數據庫獲得活性成分MOL2格式化學結構，再利用 Pubchem數據庫（https://www.pubchem.org/）轉換為PDB格式。檢索RCSB PDB數據庫（http://www.rcsb.org/）獲得蛋白晶體結構，運用Autodock[13]軟件進行去水、加氫等操作后保存為PDB格式，應用Pymol軟件對“活性成分-作用靶點”網絡中的度值大于平均值的化學成分和PPI網絡中的重要蛋白進行分子對接。

1.4 數據處理

實驗數據使用SPSS23.0統計軟件進行統計分析。所有數據用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析。使用GraphPad Prism 8.0繪制統計結果圖。

2 結果與分析

2.1 人參、桑椹單味藥及藥對對小鼠睪丸間質細胞及成骨細胞的作用

2.1.1 單味藥及藥對對小鼠睪丸間質細胞TM3增殖率的影響 見表1，與空白組比較，模型組睪丸間質細胞增殖率極顯著降低（P<0.01），表明小鼠腎衰模型建立成功。與模型組比較，當濃度為100、200 μg/mL時GW、MW、GMW、GC、MC、GMC組增殖率顯著升高（P<0.01），并且呈濃度依賴性。GMW、GMC的增殖率明顯高于GW、MW、GC、MC的增殖率（P<0.05，P<0.01）。

表1 單味藥及藥對不同組分對小鼠睪丸間質細胞的增殖作用（±s，n=3）Table 1 Proliferation effects of single drug and drug pair on mouse testicular TM3 cells (±s, n=3)

表1 單味藥及藥對不同組分對小鼠睪丸間質細胞的增殖作用（±s，n=3）Table 1 Proliferation effects of single drug and drug pair on mouse testicular TM3 cells (±s, n=3)

注：與空白組比，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比，*P<0.05，**P<0.01。

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2.1.2 GMW、GMC對小鼠睪丸間質細胞TM3睪酮分泌量的影響 通過TM3細胞增殖率的實驗可知，藥對增值率大于單味藥增值率，所以對藥對睪酮分泌進行分析。見圖1，與空白組比較，模型組睪酮分泌顯著降低（P<0.01），表明小鼠腎衰模型建立成功。與模型組比較，GMW、GMC組在25~200 μg/mL睪酮分泌顯著升高（P<0.01），并且呈濃度依賴性。

圖1 藥對水提GMW和藥對醇提GMC對TM3細胞睪酮分泌量的影響（±s，n=3）Fig.1 Effects of water extraction of GMW and alcohol extraction of GMC on testosterone secretion of TM3 cells

2.1.3 GMW、GMC對小鼠成骨細胞MC3T3-E1增殖率的影響 見圖2，與空白組比較，GMW、GMC組的細胞增殖率顯著升高（P<0.05，P<0.01）。在GMW組中200 μg/mL濃度的細胞增殖率極顯著高于其他濃度組（P<0.01）。GMC組中100 μg/mL濃度的細胞，增殖率極顯著高于其他濃度組（P<0.01）。

圖2 藥對水提GMW和藥對醇提GMC對MC3T3-E1細胞增殖率的影響（±s，n=3）Fig.2 Effects of water extraction of GMW and alcohol extraction of GMC on proliferation rate of MC3T3-E1 cells

2.1.4 GMW、GMC 對小鼠成骨細胞 MC3T3-E1 ALP活力的影響 見圖3，與空白組比較，模型組ALP活力極顯著降低（P<0.01）。與模型組比較，GMW中25 μg/mL濃度時ALP活力極顯著高于其他濃度的ALP活力（P<0.01）。GMC中200 μg/mL濃度時ALP活力極顯著高于其他濃度ALP活力（P<0.01）。

圖3 藥對水提GMW和藥對醇提GMC對MC3T3-E1細胞 ALP 活力的影響（±s，n=3）Fig.3 Effects of water extraction of GMW and alcohol extraction of GMC on ALP activity of MC3T3-E1 cells

2.2 網絡藥理學分析

2.2.1 人參-桑椹活性成分篩選及“成分-靶點”網絡構建 通過檢索TCMSP數據庫，在TCMSP數據庫檢索到人參化學成分190種，桑椹中化學成分91種；通過設置OB≥30%，DL≥0.18，人參中篩選出活性成分22種，桑椹中活性成分6種，其中兩者共有活性成分28種，見表2。并獲得活性成分相關作用靶點99個。將28種活性成分與2.2.2中所得到的交集69個關鍵靶點通過Cytoscape 3.7.0軟件構建“活性成分-靶點”網絡，見圖4。圖4中共有節點（Node）97個，邊（Edge）137條，綠色四邊形節點為人參-桑椹兩者共有成分，藍色三角形節點為靶標蛋白。通過分析網絡性質，活性成分M04、M14、M16、M27、M28的度值（Degree）高于平均值，M04、M14、M16是人參的活性成分，M27、M28是桑椹的活性成分，說明這些成分可能是人參-桑椹治療骨質疏松癥關鍵成分。

圖4 人參-桑椹藥對活性成分-靶點網絡圖Fig.4 Compound-target network of herbal pair ginseng and mulberry

表2 人參-桑椹中活性化合物的基本信息Table 2 Basic information of active compounds in ginseng-mulberry

2.2.2 藥物靶點基因篩選及關鍵基因獲取 通過檢索GeneCards數據庫、OMIM數據庫刪除重復項后得獲骨質疏松癥相關靶點4204個，與活性成分相關靶點取交集后共獲得69個關鍵靶點，見圖5。藍色圓形為活性成分靶點，紅色圓形為骨質疏松癥靶點，兩者交集為關鍵靶點。

圖5 活性成分靶點和骨質疏松癥靶點Venn圖Fig.5 Venn diagram of bioactive compound targets and Osteoporosis related targets

2.2.3 PPI網路構建與分析 將69個關鍵靶點，導入STRING數據庫，基因類型改為“Homo sapiens”，并將置信度設置為medium confidence 0.400，獲得PPI網絡圖TSV格式文件，將其導入Cytoscape 3.7.0軟件進行可視化處理，其中有4個蛋白沒有互作關系，見圖6。圖6中共涉及65個節點（Node），638條邊（Edge）。PPI網路圖中，節點顏色從淡黃色漸變至深藍色表示Closeness Centrality從小到大變化。共有30個蛋白度值高于平均值（19.6），見表3，其中度值前五的蛋白為IL6、ALB、MAPK8、VEGFA、CASP3說明這5種蛋白在網絡中與其他蛋白相互作用較多，在網絡中發揮了重要作用。

表3 30個關鍵靶蛋白Table 3 30 key target proteins

圖6 65個關鍵靶點PPI網絡圖Fig.6 PPI network of 65 key targets

2.2.4 GO功能富集和KEGG靶點通路富集分析經過DAVID數據庫分析，以P<0.05為條件共收集到257個生物過程（biological process），34個分子功能（cell compound），62個細胞組分（molecular function）和109條KEGG通路，將GO功能富集排名前30的生物過程、分子功能、細胞組分及前20的KEGG通路繪圖從數據庫導出。見圖7。所包含基因數最多的前20的通路詳細信息結果，見表4。將DAVID分析結果導入Cytoscape 3.7.0構建“活性成分-靶點-通路”網絡圖，見圖8。圖8中藍色（左圖）菱形節點為兩者共有成分，綠色（中圖）四邊形節點為關鍵靶標蛋白，紫色（右圖）長方形為通路。共有117個節點，406個邊，平均Degree值為6.719（該值是表示與該節點相連的邊的條數，節點度越高，其參與的生物過程越多），≥6.719的有44個，其介數（Betweenness Centrality）、接近中心性（Closeness Centrality）、平均最短路徑長度（Average Shortest Path Length）表明了其重要性，網絡拓撲參數，見表5。由此可知，相同成分可對應一個或多個靶點，而不同成分又可作用于同一靶點，具有協同作用。

表5 網絡拓撲參數（Degree≥6.719）Table 5 Network topology parameters (Degree≥6.719)

圖8 活性成分-靶點-通路網路圖Fig.8 Active ingredient target pathway network diagram

表4 基因數目前20的KEGG通路基本信息Table 4 Basic information of the top 20 pathways with the most genes

圖7 GO功能富集和KEGG通路富集Fig.7 GO analysis and KEGG pathways

GO功能富集表明，人參-桑椹藥對可正調控RNA聚合II啟動子轉錄（positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter）、凋亡過程負調控（negative regulation of apoptotic process）、腫瘤壞死因子細胞反應（cellular response to tumor necrosis factor）、血管生成的正向調節（positive regulation of angiogenesis）、神經元凋亡過程（neuron apoptotic process）、上皮細胞增殖的陽性調節（positive regulation of epithelial cell proliferation）等生物過程。KEGG通路分析表明人參-桑椹藥對可能通過PI3K-Akt信號通路（PI3K-Akt signaling pathway）、乙型肝炎通路（Hepatitis B）、前列腺癌通路（Prostate cancer）、MAPK 信號通路（MAPK signaling pathway）、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路（AGERAGE signaling pathway）等信號通路發揮治療骨質疏松癥的作用。“成分-靶標-通路”網絡圖分析結果顯示，槲皮素（quercetin）、山奈酚（kaempferol）、β-胡蘿卜素（beta-carotene）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）四種化合物在網絡圖中度值高于平均度值，提示這些化合物可能在人參-桑椹藥理作用的發揮中扮演重要角色。

2.2.5 分子對接驗證 利用Autodock軟件，選取“活性成分-靶點-通路”網絡圖中度值高于平均值的四個化合物（kaempferol、quercetin、beta-carotene、beta-sitosterol），與PPI網絡中度值排名前四的靶點（CASP3、ALB、IL6、MAPK8）對接，除beta-carotene與靶點對接后binding energy大于0 kcal/mol外，其余結果均小于0 kcal/mol，說明活性成分和靶蛋白能形成較為穩定的結合，見表6。利用Pymol軟件對活性化合物結果進行可視化處理結果，見圖9。由圖可知，A、B、C分別為kaempferol、quercetin、betasitosterol與CASP3蛋白對接模式圖，D、E、F分別為kaempferol、quercetin、beta-sitosterol與ALB蛋白對接模式圖，G、H、I分別為kaempferol、quercetin、beta-sitosterol與IL6蛋白對接模式圖，J、K、L分別kaempferol、quercetin、beta-sitosterol與MAPK8蛋白對接模式圖。

圖9 活性成分與CASP3、ALB、IL6、MAPK8的分子對接模式Fig.9 Molecular docking pattern of bioactive compounds with CASP3、ALB、IL6、MAPK8 main protease

表6 活性成分與關鍵靶點對接結果（kcal/mol）Table 6 Docking results of active ingredients and key targets (kcal/mol)

3 討論

人參和桑椹為補氣補陰補肝腎的中藥。骨質疏松癥現已在全球成為非常常見的疾病，并且對于抗骨質疏松癥的藥物研發迫在眉睫。中醫理論中“腎主骨生髓”證實人參-桑椹有改善骨質疏松的作用。然而其作用機制并不明確，同時缺乏分子水平實驗研究。本研究以小鼠睪丸間質細胞TM3為模型，考察了人參、桑椹單味藥和聯合藥對對睪丸間質細胞增殖及睪酮分泌的影響。結果顯示，聯合藥對對細胞增殖及睪酮分泌量具有顯著增加作用，說明藥對比單味藥具有明顯補腎的作用。以小鼠成骨細胞MC3T3-E1為模型，考察不同組分藥對對細胞增殖及ALP活力的影響，結果顯示水提取的藥對組分具有明顯細胞增殖的作用，而醇提取的藥對則對ALP活力具有明顯增強的作用。

本文基于網絡藥理學和分子對接技術研究了人參-桑椹改善骨質疏松癥的活性成分、潛在作用靶點和作用通路。發現人參-桑椹藥對可能通過 kaempferol、quercetin、beta-carotene、beta-sitosterol等 活性產物，作用于 IL6、ALB、MAPK8、VEGFA、CASP3、EGFR等靶點，正調控RNA聚合II啟動子轉錄、凋亡過程負調控、腫瘤壞死因子細胞反應、血管生成的正向調節、神經元凋亡過程、上皮細胞增殖的陽性調節等生物過程，通過PI3K-Akt信號通路、乙型肝炎通路、前列腺癌通路、MAPK信號通路、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路等發揮多成分，多靶點、多通路治療骨質疏松癥的藥理作用。

PPI網絡圖參數顯示，人參桑椹治療骨質疏松關鍵靶點主要有IL6、ALB、MAPK8、VEGFA、CASP3、EGFR等，30種蛋白度值高于平均值，這些結果表明，關鍵靶點與其它蛋白質關系密切，在PPI網絡中具有較強的相互作用。其中，白介素-6（IL-6）與OP密切相關，血清IL-6的升高是OP發病的重要危險因素[14]，IL-6能促進成骨細胞釋放白介素-1（IL-1）、前列腺素E2（PGE2）等下游信號分子，降低OPG表達，升高RANKL表達，從而促進破骨細胞形成，增強骨吸收[15]。目前認為營養不良是OP發病的重要危險因素[16]，而血清白蛋白（ALB）是衡量機體營養狀況的重要指標，臨床及實驗研究顯示[17?18]，血清中ALB水平降低與骨密度下降呈明顯正相關，證實低水平ALB與OP的發病密切相關。徐會金[19]在體外培養人的巨噬細胞實驗中發現MAPK可通過調控IRF-3來上調IFN-P基因的表達，從而起到抑制破骨分化，減弱骨吸收作用，對延緩骨質疏松癥進程起著重要作用。血管內皮生長因子A（VEGFA）是血管內皮生長因子家族中一種重要的細胞因子，可增加血管通透性，誘導血管生成。研究發現[20]，正常健康人群體內VEGF表達較OP患病人群中高的多，證實其在維持骨代謝中起到重要的作用。其治療骨質疏松癥的作用機制可能是通過刺激血管內皮，增強成骨細胞的活性以此促進成骨生成[21]，動物實驗也已證實了[22]。將表達VEGF的腺病毒載體注射到新西蘭兔股骨遠端，結果表明，表達VEGF的腺病毒載體能顯著增加兔股骨遠端的骨量和成骨細胞數量。胱冬酶3（CASP3）是細胞線粒體凋亡通路中的關鍵蛋白，正常情況下以非活化的形式存在，當細胞凋亡程序啟動時，CASP3被蛋白水解酶激活并與下游蛋白級聯以促進細胞凋亡[23]，因此調節成骨細胞及破骨細胞凋亡是許多中藥治療OP的重要作用機制[24]。EGFR是erbb家族四個成員之一的跨膜糖蛋白，構成酪氨酸激酶受體。EGFR是一種重要的生長蛋白因子，能穩定淺表軟骨細胞數量，增加邊界潤滑劑的分泌，潤滑軟骨表面，從而增強關節軟骨的力學強度[25]。研究[26]表明，EGFR的活化能高度刺激EGR-1、EGR-2和EGR-3的表達，通過促進大鼠成骨細胞和原代顱骨細胞的增殖和抑制其凋亡來維持其數量。

人參桑椹治療骨質疏松癥的KEGG通路富集結果顯示，磷脂酰肌醇三激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信號通路作為細胞分化、增殖、遷移過程中一個重要的調節者，在骨質疏松病理過程中扮演著重要角色[27]。Adapala等[28]發現抑制PI3K/Akt信號通路活性，將使破骨細胞骨吸收能力減弱，從而達到延緩骨質疏松癥進程的作用，其機制可能與激活下游的核因子κB受體活化因子（RANK）和巨噬細胞集落刺激因子受體（c-Fms）信號相關。已有研究證明病毒性肝炎患者骨質疏松癥發生率顯著增高，且與肝損害的程度呈正相關[29?30]。研究發現去勢治療前列腺癌能降低雄激素，同時經雄激素芳香化而來的雌激素也減少，雌激素通過調節核因子κB體活化因子、核因子κB受體活化因子配體、骨質疏松癥G通路，促進破骨細胞增殖、分化，促進骨吸收，從而導致骨質疏松[31?32]。目前對骨重塑機制的深入研究，慢性炎癥一定程度上參與了骨質疏松癥的發展，而這種慢性炎癥狀態及相關的氧化應激可以通過激活晚期糖基化終末產物受體抑制WNT、ERK和PI3K信號抑制成骨細胞增殖[33?34]。研究表明，骨關節炎的軟骨細胞具有更高的晚期糖基化終產物受體表達。晚期糖基化終產物激活受體可通過激活MAPK和核因子κB信號通路促進軟骨細胞的分解代謝。由此可見，糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路也有可能成為治療骨質疏松癥的潛在靶點。

通過網絡藥理學篩選，發現kaempferol、quercetin、beta-carotene、beta-sitosterol化合物在“成分-靶點-通路”網絡中度值高于平均值。因此將這四種成分與PPI網絡中度值前四的分子IL6、ALB、MAPK8、CASP3進行分子對接，結果顯示，除beta-carotene與靶點對接后binding energy大于0 kcal/mol外，其余binding energy結果均小于0 kcal/mol，說明人參-桑椹的活性化學成分可以和IL6、ALB、MAPK8、CASP3蛋白進行較穩定的結合。同時，已研究表明[35?38]，kaempferol、quercetin、beta-sitosterol均 表現出較好的抗癌、抗炎、抗氧化、抑制腫瘤及清除氧自由基的活性，表明這些成分在人參-桑椹藥對改善骨質疏松癥作用中扮演了重要角色。