銀耳芽孢多糖發酵培養基配方、發酵條件的優化及其放大發酵試驗

唐 睿，林俊芳，郭麗瓊，葉志偉，鄭倩望,

（1.華南農業大學，廣東廣州 510640；2.廣東省微生態制劑工程技術研究中心，廣東廣州 510642）

銀耳（Tremella fuciformisBerk），又稱雪耳、白木耳，屬二態型真菌，營養體具有芽孢（酵母相）和菌絲（絲狀體相）兩種細胞型態，銀耳芽孢可以通過菌絲膠質化而成的銀耳子實體組織分離后獲得的節孢子反復芽植而得[1]。銀耳多糖是銀耳的主要活性成分，銀耳芽孢多糖與銀耳子實體多糖都是銀耳多糖的重要來源[2]，研究表明兩種多糖具有相似的單糖組成，主要成分為木糖、甘露糖、葡萄糖，通過（1→3）-D-甘露糖骨架連接[3?7]。同時銀耳芽孢多糖與銀耳子實體多糖具有如抗腫瘤[8?9]、抗氧化活性[10?11]、降血糖血脂[12?13]等相似的生物活性[14?15]，可以廣泛應用在醫藥、食品等領域，具有巨大的市場價值[16]。

目前銀耳多糖一般是從銀耳子實體中提取，但銀耳子實體的栽培占地廣、周期長、受氣候季節地區性影響[17]，且其提取過程耗能大、得率低[5,18?19]，因此銀耳子實體并非銀耳多糖的合適來源途徑。銀耳芽孢可以進行液態深層發酵，能夠在較短的時間內迅速富集胞外多糖（Extracellular polysaccharides，EPS）[20]，符合工業化發展趨勢，通過提高銀耳芽孢發酵多糖的效率能夠有效促進銀耳多糖相關產品的開發。目前銀耳芽孢多糖搖瓶液態發酵已有研究，阮玲云等[21]發現低氮高鹽且pH5時有助于胞外多糖的分泌，Ma等[22]則通過響應面法優化了銀耳芽孢發酵多糖馬鈴薯培養基的添加量；但是總體來說銀耳芽孢多糖的搖瓶液態發酵體系仍未完善，所得培養基仍有如馬鈴薯淀粉等對銀耳芽孢多糖提取純度和最終產量造成干擾的因素存在。除此之外，銀耳芽孢多糖的放大發酵多集中在5 L發酵罐規模上[23?24]，缺乏更大規模的放大發酵工藝參數研究。

本研究采用單因素法探索不同來源的碳氮源及營養元素對銀耳多糖產量的影響，并結合Plackett-Burman和Box-Behnken響應面設計，得到高產EPS的發酵培養基配方和發酵條件，進一步使用50 L發酵罐進行發酵工藝的驗證，旨在為銀耳芽孢多糖液態發酵培養基所需的營養元素進行篩選以及為其工業化生產提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

銀耳芽孢菌株Y2菌種 保藏在華南農業大學微生態制劑工程技術研究中心，提取Y2菌株的基因組進行ITS鑒定，結果顯示Y2菌株與Tremellasp.相似度達99%以上，可以確定本次使用的Y2菌株為銀耳芽孢菌種；PDA培養基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、KH2PO43 g、MgSO4·7H2O 1.5 g、瓊脂粉20 g、蒸餾水1000 mL，115 ℃滅菌30 min后備用；種子培養基：葡萄糖20 g、蛋白胨4 g、K2HPO41 g、KH2PO40.46 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，蒸餾水1000 mL，115 ℃滅菌30 min后備用；基礎發酵培養基：葡萄糖20 g、蛋白胨4 g、K2HPO41.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、蒸餾水1000 mL、115 ℃滅菌30 min后備用；發酵條件優化培養基：葡萄糖20 g、酵母浸膏2 g、玉米漿干粉2 g、KH2PO41.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、蒸餾水1000 mL，115 ℃滅菌30 min后備用；甘露醇分析純，上海源葉生物科技有限公司；酵母浸膏 分析純，廣東環凱微生物氪金有限公司；蛋白胨 分析純，北京奧博星生物科技有限公司；葡萄糖、蔗糖、KH2PO4、NaCl、濃硫酸 分析純，廣州化學試劑廠；無水乙醇 分析純，天津富宇精細化有限公司；重蒸試劑 分析純，Solarbio公司。

5804R高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司；RV8旋轉蒸發儀 德國IKA公司；UV2310Ⅱ雙光束紫外分光光度計 杭州奧盛；真空冷凍干燥機北京博醫康；高壓蒸汽滅菌鍋 江陰濱江醫療設備。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株的活化與種子液培養 菌株活化：在無菌環境下用平板劃線法將冷凍管保藏的Y2菌液接種在PDA平板培養基上，于25 ℃恒溫箱中培養3 d。

種子液制備：取出恒溫箱中的平板培養基，在無菌環境下挑出單菌落，加入到預先備好的種子培養基中，放入25 ℃、150 r/min搖床中培養4 d，而后置于4 ℃冰箱備用。

1.2.2 指標測定 Y2 EPS的收集：收集發酵完畢的搖瓶里所有菌液，8000 r/min離心20 min后，收集上清，通過旋蒸儀濃縮到適當體積后用3倍體積的95%乙醇沉淀過夜，收集沉淀，復溶冷凍干燥后即為粗EPS。

標準葡萄糖曲線的繪制：精密稱取無水葡萄糖0.10 g，用超純水定容至1000 mL后準確吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL至具塞試管中，分別用超純水補足至1 mL，混勻；往試管中加入1 mL 5%苯酚和5 mL濃硫酸，渦旋振蕩5 s，40 ℃水浴30 min后取出冷卻至室溫，在OD490處測量吸光度。以吸光度為橫坐標，葡萄糖含量為縱坐標，制得葡萄糖標準曲線回歸方程為：y=0.1071x+0.0011，R2=0.9996。

銀耳芽孢多糖產量測定：稱取從發酵液（V1）中提取出的全部粗多糖樣品凍干后的干重（M），從中選取適當重量的粗多糖樣品（m）用超純水定容至一定體積（V2），得到合適濃度的多糖溶液。移取適當體積的定容后的多糖溶液至具塞試管中（v），并用超純水補足至1 mL，往試管中加入1 mL 5%苯酚和5 mL濃硫酸，渦旋振蕩5 s，40 ℃水浴30 min后取出冷卻至室溫，在OD490處測量吸光度。多糖產量按下式計算：

式中：Y表示發酵液（V1=100 mL）中EPS的產量，mg/100 mL；V1表示用于提取多糖的發酵液體積，mL；V2表示樣品定容體積，mL；M表示所得粗EPS的干重，mg；y表示根據吸光值從標準曲線上求得的測定液中含糖量，mg；v表示移取樣品測定液的體積，mL；m表示定容時溶解粗EPS的質量，mg；0.9表示葡萄糖換算成葡聚糖的校正系數[25]。

1.2.3 發酵培養基配方優化 初始發酵培養基的配方為：葡萄糖20 g，酵母浸膏4 g，K2HPO41.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，加入純水攪拌溶解，定容至1000 mL；初始發酵條件為：裝液量100 mL/250 mL、接種量為1%（v/v）、自然pH、25 ℃、150 r/min搖床、發酵時間6 d。

1.2.3.1 發酵培養基氮源篩選 單一氮源篩選：在供試基礎發酵培養基的基礎上進行總添加量為0.4%的不同氮源替換（NaNO3、NH4Cl、豆粕提取粉、黃豆餅粉、玉米漿干分、酵母浸膏、酵母提提取粉、胰蛋白胨、蛋白胨），保持其他成分不變，6 d后測量EPS的產量。

復合氮源篩選：在供試基礎發酵培養基的基礎上，兩種氮源以1:1的比例，總添加量為0.4%進行復合氮源的搭配替換，其他成分保持不變，發酵完成后測量EPS的產量。以最優復合氮源為研究對象，進行復合氮源比例（0.75:1.25、1:1、1.25:0.75）以及總添加量（0.3%、0.4%、0.5%、0.6%（w/v））的篩選，6 d后測量EPS的產量。

1.2.3.2 發酵培養基碳源篩選 以上述篩選后的氮源培養基為基礎，進行總添加量為2%的不同碳源的替換（葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇），保持其他成分和發酵條件不變，發酵完成后測量EPS的產量。以最優碳源為研究對象，進行碳源添加量（0.5%、1%、2%、3%、4%（w/v））的篩選，發酵完成后測量EPS產量。

1.2.3.3 發酵培養基無機鹽篩選 以上述篩選后的培養基為基礎，無機鹽分別替換為無無機鹽組、只添加磷酸氫二鉀（0.10%）組、磷酸二氫鉀（0.10%）組、硫酸鎂（0.05%）組、氯化鈉（0.05%）組。發酵完成后測量EPS產量，選取明顯促進EPS產量的鹽離子進行添加量的優化，其中磷酸鹽的優化范圍為0.05%、0.10%、0.15%；其余無機鹽優化范圍為0.025%、0.05%、0.075%。

1.2.3.4 Plackett-Burman設計 在工藝優化中，采用Plackett-Burman設計能用較少的實驗次數在眾多的因素中快速篩選出對目的指標影響最顯著的因素，對節約實驗材料和縮短試驗時間有著重要的作用[26]。依據實驗結果，選取復合氮源（X1）、葡萄糖（X2）、磷酸二氫鉀（X3）、硫酸鎂（X4）、氯化鈉（X5）5個因素，用Design-Expert軟件進行Plackett-Burman設計，篩選出對Y2發酵ESP影響較顯著的3個因素，PB試驗因素與水平見表1。

表1 PB試驗設計因素水平Table 1 Plackett-Burman experimental design factor level

1.2.3.5 Box-Behnken設計 根據PB試驗結果選擇對多糖產量影響最顯著的3個因素，以EPS產量為響應值，用Design-Expert進行Box-Behnken設計3因素3水平響應面試驗。響應面設計因素與水平見表2：

表2 Box-Behnken試驗設計因素與水平Table 2 Factors and levels of Box-Behnken design

1.2.4 發酵條件優化 發酵條件優化培養基的配方為：葡萄糖20 g，玉米漿干粉2 g，酵母浸膏4 g，KH2PO41.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，加入純水攪拌溶解，定容至1000 mL；初始發酵條件為：裝液量100 mL/250 mL、接種量為1%（v/v）、自然pH、25 ℃、150 r/min搖床、發酵時間6 d。

在上述發酵條件優化培養基及發酵條件為前提，進行發酵時間（4、5、6、7、8 d）；發酵溫度（21、23、25、27、30 ℃）；初始發酵pH（4、5、6、7、8）；接種量（0.5%、1%、2%、3%、4%（v/v））；搖床轉速（100、125、150、175、200 r/min）的優化，發酵后測定ESP產量。

1.2.5 發酵罐放大模擬發酵驗證 為更好的將上述發酵工藝優化結果應用于實際生產，以最佳培養基配方及條件進行50 L的發酵罐發酵。發酵罐參數為：裝料量30 L，接種量為3%（v/v），轉速100 r/min，初始pH5.5，初始通氣量為800 L/h，12 h后提高至2500 L/h，60 h后恢復到1000 L/h，培養溫度27 ℃，從發酵罐中每12 h取50 mL樣至無菌離心管中，分別測定菌體干重及EPS產量。

1.3 數據處理

本研究涉及的數據均設計三次平行，用SPSS 22.0軟件對數據進行ANOVA同時加入Duncan多重比較進行顯著性分析，用Origin 9.5軟件進行繪圖，用Design-Expert 10.0進行Plackett-Burman試驗與Box-Behnken試驗設計的數據處理。

2 結果與分析

2.1 發酵培養基氮源篩選

氮源對微生物的生長至關重要，而不同的微生物有自身的氮源需求，從圖1得知，在單一氮源添加時Y2利用不同氮源產EPS的能力差異較大，對于無機氮源以及部分蛋白類氮源利用率不高，其中酵母浸膏和玉米漿干粉對Y2產EPS有較好的提升。

圖1 單一氮源種類對Y2產EPS的影響Fig.1 Effect of the type of single nitrogen source on Y2 EPS production

在一些微生物深層發酵的過程中，復合氮源提供了更多元的營養物質，對促進微生物的生長和活性物質的分泌效果優于單一氮源[27]。由圖2可知酵母浸膏與其他氮源組合后能有效促進銀耳芽孢EPS的分泌，這可能是由于在不同氮源下Y2固碳效率或碳平衡控制有差異[28]，有酵母浸膏存在的復合氮源不僅能為培養基提供了更多元的氮源成分，還能進一步刺激Y2分泌胞外多糖。在所有復合氮源的組合中，酵母浸膏與玉米漿干粉組合時孢子干重和EPS產量是最優的，同時農副氮源玉米漿干粉的選擇也能降低培養基成本，因此選取此組合為最佳氮源。

圖2 復合氮源種類對Y2產EPS的影響Fig.2 Effect of the type of compound nitrogen source on Y2 EPS production

根據表3篩選結果可知在兩種氮源以1：1的比例添加時EPS的產量更優，由此選擇這個比例的復合氮源進行添加量的篩選，結果如圖3所示，在氮源添加量為0.4%（w/v）的時候EPS產量最高，故選擇添加量為0.4%（w/v）。

表3 復合氮源比例對Y2產EPS的影響Table 3 Effect of compound nitrogen source ratio on Y2 production of EPS

圖3 復合氮源添加量對Y2產EPS的影響Fig.3 Effect of compound nitrogen source addition on Y2 production of EPS

2.2 發酵培養基碳源篩選

碳源是構成細胞物質的基本元素和提供其生長發育所需要的基本能量，合適的碳源對微生物液體深層發酵合成多糖有明顯影響[29]。由圖4A可知，與不添加碳源試驗組比較，供試碳源除了乳糖外均能顯著(P<0.05) 促進Y2菌體的生長和EPS的分泌，其中當碳源為葡萄糖的時候多糖產量最高，同樣為單糖的果糖次之。可以表明銀耳芽孢能利用單糖和糖醇以及部分二糖來生產EPS，但單糖對Y2產EPS的誘導效果更好。

從圖4B可以看出培養基中葡萄糖濃度對Y2分泌EPS有較明顯的影響，碳源濃度過低時不足以提供細胞生長所需營養，EPS的分泌受限；而高濃度的碳源，又會引發碳源阻遏效應降低EPS的合成[30]。在添加量為3%（w/v）的時候EPS產量最高，因此葡萄糖的最佳添加量為3%（w/v）。

圖4 碳源種類（A）及碳源添加量（B）對Y2產EPS的影響Fig.4 Effect of type（A）and addition（B）of carbon sources on Y2 Production of EPS

2.3 發酵培養基無機鹽篩選

從圖5中可知，玉米漿干粉作為農副氮源，其內含有一定的礦質元素，所以在不添加無機鹽的培養基中依然有EPS的分泌，但磷酸二氫鉀、硫酸鎂和氯化鈉的添加能進一步促進Y2產EPS，而磷酸氫二鉀的添加會減少EPS的產量。

圖5 無機鹽對Y2產EPS的影響Fig.5 Effect of inorganic salt on Y2 Production of EPS

選取了能提高EPS產量的三種無機鹽加入培養基中替換原有無機鹽成分，從表4可知，添加了氯化鈉后Y2的EPS產量為173.87 mg/100 mL左右，比未添加氯化鈉的培養基產量高了1.19倍。有研究表明，Na+是銀耳芽孢生長所必要的元素[31]，除此之外NaCl還具有誘導胞外多糖的分泌的能力[32]，說明氯化鈉也是銀耳芽孢分泌EPS的關鍵有效成分，而此前銀耳芽孢發酵多糖的培養基的報道中均無此成分。磷酸二氫鉀、硫酸鎂、氯化鈉的最優添加量分別為0.1%、0.05%、0.05%。

表4 無機鹽添加量對Y2產EPS的影響Table 4 Effect of addition of Inorganic salt on Y2 production of EPS

2.4 Plackett-Burman試驗結果

利用Design-Expert10.0.4軟件對表5數據進行處理，結果如表6所見。模型F值為78.15，表明該設計模型具有重要意義，R2=0.9949表明存在99.49%的數據能用此模型解釋。葡萄糖對EPS的合成影響極顯著（P<0.01），NaCl、復合氮源對EPS合成影響顯著（P<0.05），KH2PO4和MgSO4對EPS合成影響不顯著。因此，選擇葡萄糖、NaCl以及復合氮源這3個因素及其對應的取值水平進行響應面試驗。

表5 Plackett-Burman試驗設計矩陣與結果Table 5 Plackett-Burman design matrix and results

表6 Plackett-Burman試驗回歸方程方差分析Table 6 Analysis of variance of Plackett-Burman test regression equation

2.5 Box-Behnken試驗結果

對葡萄糖（X1）、NaCl（X2）、復合氮源（X3）3個單因素進行回歸擬合，響應面結果見表7，得出EPS產量（Y）回歸方程：Y=191.00+17.69X1+2.85X2?6.0X3?3.45X1X2?8.53X1X3?13.39X2X3?18.77X12?8.19X22?18.55X32。

表7 Box-Behnken試驗設計矩陣與結果Table 7 Box-Behnken experimental design matrix and results

利用Design-Expert10.0.4軟件對回歸方程進行方差分析，結果見表8。模型“Prob>F”值為0.0003，表明該模型具有統計學上的顯著性，同時失擬項檢驗P>0.05，模型決定系數R2=0.9634，說明實際數值能與模型預測吻合。回歸方程各項方差分析表明，因素X1對EPS產量的線性效應影響極顯著，X12對EPS產量的曲面效應影響也極顯著，表明葡萄糖添加量是Y2產EPS的關鍵因素，另外X2X3對EPS產量影響也極顯著，表明復合氮源和氯化鈉添加量的交互作用對EPS產量也極顯著影響。此外，對表8進行分析可得到交互影響作用大小排序為：NaCl和復合氮源>葡萄糖和復合氮源>葡萄糖和NaCl。三因素對多糖含量的影響大小依次是：葡萄糖>復合氮源>NaCl。

表8 回歸模型方差分析Table 8 Analysis of variance in regression model

固定其中一個因素，利用Design-Expert對另外兩個因素的交互作用作曲面圖和等高線圖，如圖6所示。可知葡萄糖濃度、NaCl濃度以及復合氮源濃度相互作用時對Y2的EPS產量影響均為凸面拋物線型關系，所得的響應面都存在極大值點。

從圖6A中可以看出，X1和X2的交互作用等高線近似圓形，說明兩者之間的交互作用比較弱。從響應曲面上看，當葡萄糖濃度維持不變時，EPS產量隨NaCl濃度的變化不顯著，當NaCl的濃度維持不變時，EPS產量隨著葡萄糖濃度的升高而顯著增大，且葡萄糖濃度在3%~4%之間時EPS產量最大，說明葡萄糖濃度對EPS產量的影響比NaCl濃度更顯著。

從圖6B中可以看出，X1和X3的交互作用等高線近似橢圓形，說明兩者之間的的交互作用較強。從響應曲面上看，當葡萄糖濃度維持不變時，EPS產量隨復合氮源濃度的變化不顯著，當復合氮源的濃度維持不變時，EPS產量隨著葡萄糖濃度的升高而增大，說明葡萄糖濃度對EPS產量的影響比復合氮源的濃度更顯著。

圖6 各因素交互作用對EPS產量影響的響應面圖Fig.6 Response surface plots showing the interactive effects of various factors on EPS production

從圖6C中可以看出，X2和X3的交互作用等高線近似橢圓形，等高線較為扁平，說明兩者之間的的交互作用較強，即復合氮源與NaCl的濃度間有明顯的交互作用。從響應曲面上看，當NaCl濃度一定時，EPS產量隨復合氮源濃度的增加呈現先上升后下降的趨勢；而當復合氮源濃度一定時，EPS產量隨NaCl濃度的增加而緩慢增長，直至達到最大值后逐漸減小，且響應曲面上X3面的陡峭程度要大于X2面，因此說明復合氮源濃度對EPS產量的影響比NaCl的濃度更顯著。綜上所述，3個因素對EPS產量的影響顯著性順序為：葡萄糖濃度>復合氮源濃度>NaCl濃度，與方差分析結果一致。

對回歸模型進行優化分析，獲得銀耳芽孢Y2產EPS最佳培養基配方為葡萄糖添加量35.32 g/L、NaCl添加量0.60 g/L、復合氮源添加量3.57 g/L，在此優化條件下得出的EPS產量理論預測值為198 mg/100 mL。結合實際情況，最終選取葡萄糖添加量35 g/L、NaCl添加量0.6 g/L、復合氮源添加量3.6 g/L來對此優化條件進行驗證，通過3次驗證實驗，最終EPS的平均產量為201.61 mg/100 mL，與預期結果相當，說明此回歸模型能夠良好地對銀耳芽孢高效發酵培養基產胞外多糖進行預測。

2.6 發酵條件篩選

在發酵過程中，溫度主要通過影響細胞膜的流動性和生物大分子的活性，進而影響微生物生命活動及產物代謝[30]。從圖7A可知，隨著發酵溫度的升高EPS產量也有所上升，27 ℃的發酵溫度適合Y2產EPS，過高的溫度不利于EPS的分泌。因此選取最適發酵溫度為27 ℃。

發酵液起始pH的變化會直接影響食用菌菌絲體細胞內pH的變化，進而影響到細胞內酶的活性以及菌株對培養基基質的利用速率，因此過酸和過堿的培養及環境對EPS的生產有所抑制[33]。從圖7B中可知，pH為5時的初始發酵pH下Y2 EPS產量最高。故而選取pH5為最適起始發酵pH。

從圖7C中可知，發酵時間較短時，EPS產量不高，因為在發酵前期，培養基中的營養物質大多用于菌種自身的繁殖生長，代謝產物分泌較少，而隨著發酵時間的延長，Y2生長開始減緩，EPS開始累積，在第6 d的時候達到EPS產量的最大，而后隨著培養基營養物質的消耗以及有毒物質的積累，EPS產量開始下降。因此選擇最適發酵時間為6 d。

從圖7D中可知，當接種量在3%（v/v）時，Y2產EPS達到最優，可能是由于較少的接種量會推遲Y2大量分泌代謝產物的時期，減緩Y2對培養基基質的利用效率；而過高的接種量會導致菌株生長過快，培養基黏度升高，溶氧量下降，導致EPS分泌下降。因此選擇最佳接種量為3%（v/v）。

從圖7E可見，150 r/min左右的轉速下Y2產EPS沒有明顯差異，150 r/min的轉速要比其他轉速稍微高一點，而過高或過低的搖床轉速都不利于Y2產胞外多糖，可能是由于轉速低時，培養基溶氧量低，芽孢生長緩慢；當轉速增加，高剪切速率不適宜芽孢發酵分泌多糖。因此選擇最佳搖床轉速為150 r/min。

圖7 發酵條件對Y2產EPS影響Fig.7 Effect of Fermentation conditions on Y2 Production of EPS

綜上結果，最終確定銀耳芽孢多糖發酵條件為：培養時間6 d，初始pH5，發酵溫度27 ℃，接種量3%，搖床轉速為150 r/min。采用此最優發酵條件以及最優發酵培養基配方進行發酵，測得EPS產量為214.45±11.26 mg/100 mL，在搖瓶發酵階段達到了較高的產量水平。

2.7 發酵罐擴大模擬發酵驗證

應用最佳發酵培養基配方，在50 L攪拌式發酵罐中進行擴大分批發酵，從圖8中可見在發酵罐中Y2生長迅速，在72 h后達到了生長的穩定期；此時EPS也開始加速積累，在132 h達到最高，之后EPS的產量開始下降。此刻Y2的孢子產量為15.03 g/L、EPS的產量為258.78 mg/100 mL，EPS的產量比搖瓶實驗產量提高了21.03%，說明此發酵工藝成功在50 L發酵罐中進行了擴大發酵。

圖8 50 L發酵罐中孢子及多糖產量的變化曲線Fig.8 Variation curve of spores and ESP yield in 50 L fermentation tank

3 結論

本研究采用單因素實驗，發現酵母浸膏和玉米漿干粉1:1的復合氮源組合以及氯化鈉組分能有效提高銀耳芽孢胞外多糖產量。隨后結合Plackett-Burman和Box-Behnken響應面設計優化了培養基各組分的最適添加量，開發了高產銀耳芽孢胞外多糖的發酵培養基，其配方為：葡萄糖35 g/L，NaCl 0.6 g/L，復合氮源3.6 g/L，MgSO40.5 g/L，KH2PO41 g/L。同時，最適發酵條件為：27 ℃，pH5，發酵時間6 d、接種量3%（v/v）、搖床轉速150 r/min。優化后銀耳芽孢胞外多糖的產量為214.45 mg/100 mL。應用優化后的發酵培養基成分在50 L發酵罐擴大發酵中驗證多糖得率為258.78 mg/100 mL，比搖瓶實驗得率提高了21.03%。本次實驗探索了不同營養物質對銀耳芽孢發酵EPS的影響，得到了高效發酵EPS的銀耳芽孢發酵培養基添加配方及發酵條件，同時中試放大發酵試驗也為銀耳芽孢多糖的大規模工業生產提供了工藝參數參考和理論支持。