Fe3O4@ZrO2磁納米粒子在酪蛋白磷酸肽富集中的應用

潘玉婷，楊 靜，嚴新宇，李 娜

（浙江九安檢測科技有限公司，浙江杭州 310053）

酪蛋白磷酸肽（Casein Phosphopeptides，CPP）是一類含有磷酸絲氨酸的短肽，作為食品添加劑使用，安全性很高。目前，國內外有很多CPP生理功能的研究報道。研究表明，CPP可以防止鈣在小腸內沉淀，顯著促進鈣的吸收，并對鈣的代謝產生積極的影響[1?3]；可防齲齒，作為牙齒抗菌劑和再礦化劑加入牙膏中[4?5]；可防牙釉質脫礦，有效恢復牙釉質漂白過程中鈣的丟失[6?7]；具有抗腫瘤、抗菌、免疫調節和細胞調節等特性[8]。

在食品領域中，傳統的CPP分離技術（鈣-乙醇沉淀法、離子交換法、膜分離法）步驟復雜、成本高、較難實現工業化[9]。近年來，金屬氧化物（如二氧化鈦、二氧化鋯）涂層吸附劑已被證實為磷酸肽富集的有效材料，和最常用的金屬離子親和吸附法相比，它除了具有親屬離子親和吸附的所有優點外，還解決了金屬離子的殘留問題，并且對磷酸肽有更強的特異吸附性，材料也更易重復使用[10?11]。此外，磁性親和探針因其磁特性而易于從樣品溶液中分離出與磁材料特異結合的目標物，極大地縮短了分離所需時間。在磷酸化蛋白質組學中，有諸多關于磁性粒子快速分離一些目標分析物的研究[12]。許多金屬氧化物（包括TiO2和SiO2等）包覆的Fe3O4磁性微球被合成，并成功地應用于磷酸化蛋白組學中，進行選擇性富集磷酸化肽的研究[13?14]，在食品工業磷酸肽富集工藝中的應用卻鮮有報道。因此本文采用金屬氧化物親和磁性納米粒子（Fe3O4@ZrO2）作為富集CPP的載體，對高質量高純度CPP 的生產具有重要的指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

七水硫酸亞鐵（FeSO4·7H2O）、六水氯化鐵（FeCl3·6H2O）、聚乙二醇6000（PEG 6000）、25%氨水、95%乙醇、八水氯氧化鋯（ZrOCl2·8H2O）、干酪素、胰蛋白酶、氫氧化鈉、冰醋酸、乙酸鈉 分析純，國藥集團化學試劑有限公司；實驗中所用水 均為GB/T 6682規定的二級水。

H-7650透射電子顯微鏡 日本Hitachi公司；DK-S28型電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實驗設備有限公司；AM-6250B型恒溫磁力攪拌器 天津奧特賽恩斯儀器有限公司；FE20K型pH計、AB104-N電子分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；冷凍干燥機 美國Labconco公司；Sigma 6-15大容量離心機 鄭州南北儀器設備有限公司；ZHWY-2102恒溫搖床 上海智城分析儀器制造有限公司；SHB-Ⅲ循環水式多用真空泵 鄭州長城科工貿有限公司；IKA旋轉蒸發儀RV10 上海楚柏實驗室設備有限公司；IKA數顯加熱鍋HB10 北京海淀晶晶科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 Fe3O4@ZrO2磁納米粒子的制備 采用化學共沉淀法制備Fe3O4@ZrO2磁性納米粒子[15?17]。配制水和無水乙醇的混合溶液（體積比5:1）于四口燒瓶中，將一定量的FeSO4·7H2O和FeCl3·6H2O加入四口燒瓶中（總鐵離子濃度為0.03 mol/L，Fe2+與Fe3+摩爾比2:3），通入保護氣（N2），以800 r/min持續攪拌，待溶解后，加入一定量的聚乙二醇6000，升溫至60 ℃，使用滴液漏斗緩慢加入沉淀劑25%NH3·H2O，使體系的pH≥10，水浴恒溫15 min后，加入8.5% ZrOCl2·8H2O溶液，升溫至80 ℃，恒溫1 h后結束反應。用蒸餾水反復洗滌直至中性，傾去上層清液，冷凍干燥48 h后，研磨即得Fe3O4@ZrO2磁納米粒子，并通過投射電子顯微鏡獲得其微觀形態，通過外加磁場觀察其磁性。

1.2.2 CPP的制備工藝 參考文獻[18]：取500 mL蒸餾水置于酶解器中50 ℃循環水浴預熱，再加入25 g干酪素，預熱至50 ℃，用10 mol/L NaOH調pH至8.0，穩定15 min后，加入適量胰蛋白酶，即刻計時，用堿式滴定管加入0.5 mol/L的NaOH溶液調pH至8.0并在反應中保持該pH；記錄消耗NaOH的量V（NaOH）；反應3 h后將樣品溶液轉移至大燒杯中，于90 ℃水浴鍋中加熱滅酶10 min，冷卻至室溫，用冰醋酸調pH至4.5，離心（8000 r/min，4 ℃）20 min，取上清液置于40 ℃恒溫水浴，壓強600 mm汞柱的旋轉蒸發儀中，80 r/min濃縮約3 h，至20 min內不再有冷凝液滴出，再冷凍干燥，研磨混勻制得CPP粗品。

采用pH-Stat法，記錄酶解期間消耗的0.5 mol/L NaOH溶液的量V（NaOH），計算水解度（DH，%）：

式中：VNaOH為水解過程中用去的NaOH的量（mL）；CNaOH為NaOH的濃度（mol/L）；MP為蛋白質總量（g）；htot為每克蛋白質中肽鍵的克當量，即原料蛋白質中肽鍵被裂解的百分數，其表示蛋白質被酶催化水解的程度，對于某一特定的蛋白質來說是一個常數，酪蛋白htot=8.2；1/a為氨基酸解離度（pH8.0，50 ℃時，1/a=1.13）。

1.2.3 用金屬氧化物磁性材料Fe3O4@ZrO2納米粒子富集CPP 在預先配制的乙酸-乙酸鈉緩沖液（0.2 mol/L）中加入一定質量的CPP制成CPP溶液，并置于一定溫度恒溫搖床中進行預熱，之后加入適量Fe3O4@ZrO2磁性材料在恒溫搖床中進行吸附。吸附結束后，在磁場作用下，將吸附有CPP的材料從肽溶液中分離取其上清液，即未被吸附的CPP的量。

酪蛋白分子含有的磷酸基數量是一定的，N/P較小則產品中不含磷酸基的肽段被切除和分離的越多，CPP制品的磷酸基含量相對較高。馮鳳琴等[19]對不同來源的CPP的N/P、分子大小及結合鈣的最大量進行分析和測定，得出N/P越小，則CPP制品的純度越高或磷酸基密度越大。因此，CPP中氮與磷的摩爾比值（即N/P）能客觀、綜合地反映CPP肽鏈的長短、磷酸基密度、產品的純度及結合鈣能力等理化性質，本實驗以N/P和吸附量作為評價指標[20]。

用緩沖液沖洗材料，再加入一定pH的NaOH溶液，置于一定溫度恒溫搖床中進行洗脫。洗脫結束后，在磁場作用下，將材料從溶液中分離出來，得到上清液，此即解析下來的CPP的量，測其N/P及洗脫率[21?22]。

1.2.4 實驗設計 影響金屬氧化物磁性材料Fe3O4@ZrO2磁納米粒子富集CPP的因素很多，需進行單因素實驗來選取最佳工藝。首先恒定CPP溶液的pH為6、CPP溶液的初始濃度為40 mg/mL、吸附時間為30 min、吸附溫度為30 ℃等實驗條件，研究酪蛋白水解度對富集實驗的影響，CPP水解度區間范圍選擇為12%~22%。之后依次確定CPP溶液pH、吸附時間、吸附溫度、CPP溶液初始濃度的最佳條件。

1.3 數據處理

1.3.1 N/P的計算 用N/P（摩爾比）來衡量CPP的純度，按下式計算：

式中，R為最終得到產物的N/P；CoN為原溶液中N的質量濃度（mg/mL）；CeN為磁納米粒子吸附后的上清液中N的質量濃度（mg/mL）；CoP為原溶液中P的質量濃度（mg/mL）；CeP為磁納米粒子吸附后的上清液中P的質量濃度（mg/mL）；31為P的相對分子質量；14為N的相對分子質量。

1.3.2 吸附量的計算

CoN：原溶液中N的質量濃度（mg/mL）；CeN：磁納米粒子吸附后的上清液中N的質量濃度（mg/mL）。

1.3.3 洗脫率的計算

X：洗脫率，%；m1：磁納米粒子上吸附的蛋白質的含量（g）；m2：洗脫下來的蛋白質的含量（g）。

2 結果與分析

2.1 Fe3O4@ZrO2納米粒子的表征

用透射電子顯微鏡（TEM）表征Fe3O4@ZrO2納米粒子。

由圖1可知，Fe3O4@ZrO2磁納米粒子呈球形，粒徑約為50 nm。由圖2可知，在外加磁場的作用下，具有超順磁性的納米粒子可向磁場方向聚集，撤去磁場后，又可迅速分散，不會被永久磁化。

圖1 Fe3O4在修飾ZrO2后的TEM照片Fig.1 TEM graph of Fe3O4 after coating with ZrO2

圖2 水溶液中的Fe3O4@ZrO2磁納米粒子在磁場輔助下的超順磁性Fig.2 Superparamagnetism of Fe3O4@ZrO2 magnetic nanoparticles in aqueous solution assisted by applied magnetic field

2.2 水解度對Fe3O4@ZrO2磁納米粒子富集CPP的影響

采用pH-Stat法，測定CPP水解度。水解時間對水解度的影響結果見圖3，由圖3可知，水解度隨酶解時間的增加而增加，但是隨著后期時間的延長，到達一定時間后，曲線的斜率變化不是很明顯，說明水解反應基本結束，故本實驗選用的水解度區間范圍為12%~22%。而水解度與NaOH的消耗量為正比，因此，可以通過控制滴加堿液量來控制水解度大小[23]。

圖3 不同酶解時間對CPP水解度的影響Fig.3 Effect of different enzymatic hydrolysis time on the degree of hydrolysis of CPP

水解度對N/P和吸附量的影響見圖4，由圖4可知，在實驗所選擇的水解度范圍內，隨著水解度的升高，被Fe3O4@ZrO2磁納米粒子吸附上的CPP的N/P隨之降低，當水解度22%時N/P達到最低。因為隨著水解度提高，高分子量組分降低，CPP肽鏈縮短，而CPP含有的磷酸基數量是一定的，所以N/P越小則產品中不含磷酸基的肽段被切除和分離的越多，CPP制品的磷酸基含量相對越高，純度越高[24]。

圖4 水解度對Fe3O4@ZrO2磁納米粒子富集CPP N/P與吸附量的影響Fig.4 Effects of degrees of hydrolysis on the N/P and adsorption capacity of CPP enriched by Fe3O4@ZrO2 magnetic nanoparticles

被Fe3O4@ZrO2磁納米粒子吸附上的CPP的吸附量變化隨水解度的提高大致呈現上升趨勢，當水解度達到22%時，所能達到的N/P最低且吸附量最高。可能是肽鏈越短的CPP越容易被本材料吸附。綜上表明，富集CPP的最適酪蛋白水解度為22%。

2.3 肽溶液pH對Fe3O4@ZrO2磁納米粒子富集CPP的影響

從圖5中可知，被Fe3O4@ZrO2磁納米粒子吸附上的CPP的N/P先隨著pH的升高而逐漸降低，當pH為4.5時N/P達到最低，隨后隨著pH的升高而升高。同時從吸附量上分析，pH為4.5和5時較低，其他pH條件下較高，應該是Fe3O4@ZrO2磁納米粒子吸附了磷酸肽的同時，也吸附了非磷酸肽。再來比較pH為4.5和5時的吸附量可知，pH為4.5時的吸附量較高，這說明pH4.5的吸附條件所富集的CPP純度最高，且吸附量也較pH5時的高。在酸性條件下，ZrO2能夠選擇性吸附磷酸肽是因為ZrO2具有強路易斯酸的性質，隨著pH的升高，ZrO2的路易斯酸性能損耗更多，磷酸肽不再是主導品種，所以CPP的純度降低，N/P值就隨之升高[11]。

圖5 pH對Fe3O4@ZrO2磁納米粒子富集CPP N/P與吸附量的影響Fig.5 Effect of pH on the N/P and adsorption capacity of CPP enriched by Fe3O4@ZrO2 magnetic nanoparticles

綜上表明，CPP溶液的pH對Fe3O4@ZrO2磁納米粒子富集CPP的能力影響較大，該材料富集CPP的最適pH為4.5。

2.4 吸附時間對Fe3O4@ZrO2磁納米粒子富集CPP的影響

介于磁納米粒子的優點：具有較小的粒徑和較大的比表面積，從圖6中可知，初始階段吸附速率較快，N/P值下降較快，隨著時間的繼續延長，N/P值趨于平穩。原因是在反應進程中，底物不斷減少，同時吸附劑的作用位點逐漸飽和，使得吸附速度逐漸下降，經過30 min，所吸附的CPP純度基本達到平衡[17]。

圖6 吸附時間對Fe3O4@ZrO2磁納米粒子富集CPP N/P與吸附量的影響Fig.6 Effects of adsorption time on the N/P and adsorption capacity of CPP enriched by Fe3O4@ZrO2 magnetic nanoparticles

在25 min之前，隨著時間的延長，吸附量不斷下降，當N/P較高時，CPP的肽鏈較長，純度較低，而隨著CPP的肽鏈縮短，N/P不斷降低，磁納米粒子的吸附量也隨之降低；25 min之后，吸附量逐漸增大，到了50 min后趨于水平，說明50 min時磁納米粒子的吸附能力已達到飽和。且吸附時間過長不僅會導致能量的浪費，還對磁納米粒子的使用壽命也有一定的影響。所以吸附時間設定為50 min最優。

2.5 吸附溫度對Fe3O4@ZrO2磁納米粒子富集CPP的影響

從圖7中可知：在30 ℃之前，N/P下降很快，吸附量也相應降低，30 ℃之后，隨著溫度的進一步提高，N/P卻略有升高，吸附量變化不明顯。說明適當的吸附溫度，有利于提高富集效果。一方面應該是磁納米粒子與CPP之間的相互作用力隨溫度的升高而增加，另一方面應該分子運動隨溫度的升高而加速，磁納米粒子與 CPP 之間的碰撞幾率會增大，從而也有利于CPP 的富集[25]。結果表明，吸附溫度設定為30 ℃最優。

圖7 吸附溫度對Fe3O4@ZrO2磁納米粒子富集CPP N/P與吸附量的影響Fig.7 Effects of adsorption temperature on the N/P and adsorption capacity of CPP enriched by Fe3O4@ZrO2 magnetic nanoparticles

2.6 肽溶液初始濃度對Fe3O4@ZrO2磁納米粒子富集CPP的影響

從圖8中可知，隨著CPP溶液初始濃度的增加，所得CPP的N/P變化較大，最低達到4.87，而當初始濃度大于50 mg/mL時，所得肽的N/P趨于平衡。因為初始濃度較低，載體與底物之間的碰撞幾率較小，結合機率也相應較小，因此富集效果較差，導致所得CPP的純度較低，因此適宜濃度的CPP溶液有利于提高富集效果。

圖8 Fe3O4@ZrO2磁納米粒子富集CPP初始濃度對N/P與吸附量的影響Fig.8 Effects of different initial concentration on the N/P and adsorption capacity of CPP enriched by Fe3O4@ZrO2 magnetic nanoparticles

吸附量在肽溶液濃度為30 mg/mL之前呈上升趨勢，在30 mg/mL時達到最大，之后下降，40 mg/mL之后趨于水平。在肽溶液濃度為30mg/mL之前，由于濃度太低，Fe3O4@ZrO2磁納米粒子所吸附的非磷酸肽隨著濃度的增加也增多。在肽溶液濃度為50 mg/mL之后，N/P趨于水平，吸附量也相應基本不變。

綜上表明，在本實驗條件下，當CPP溶液的初始濃度為50 mg/mL時，Fe3O4@ZrO2磁納米粒子對CPP產生有效吸附的位點已經基本達到飽和。

2.7 洗脫實驗

將富集得到的含有CPP的Fe3O4@ZrO2磁納米粒子溶于不同pH的NaOH溶液中進行洗脫，分別以N含量和P含量作為評價指標，洗脫效果見圖9。結果表明，無論從N含量分析還是從P含量分析，其趨勢都相同：當NaOH溶液的pH達到13時，超過95%的CPP即可被有效洗脫。

圖9 不同pH條件下N含量和P含量的洗脫率Fig.9 Elution rate of N content and P content at different pH

3 結論

綜合上述研究，所得結果：采用Fe3O4@ZrO2磁納米粒子富集CPP，過程便捷，N/P下降明顯，所得CPP的純度較高，說明所用Fe3O4@ZrO2磁納米粒子對CPP具有較好的特異吸附性能，Fe3O4@ZrO2磁納米粒子在CPP分離純化中具有廣闊的應用潛力。

由于實驗室與工業化的生產有一定的區別，工業化生產的操作過程較粗糙、簡陋一些，因此結果會有一定的不同，但總的生產工藝是相同的。因此應該在實驗室研究的基礎上進行工廠試驗，以得到良好的社會效益。此外，本實驗的洗脫液采用濃堿，之后必須進行酸堿中和過程，造成脫鹽的問題，為后續工藝增加了繁瑣性。且采用濃堿作為洗脫液的確會對最終所得CPP產品帶來影響，因為CPP在堿性條件下，穩定性較差，所以洗脫之后必須馬上對CPP溶液進行酸堿中和處理。希望后續研究者能找到更好的洗脫液來提高材料的重復利用率和CPP的產品質量。