高效液相色譜-串聯質譜法測定鲆鰈類水產品中喹諾酮的不確定度評定

范廣宇 ，唐 秀，張 琳，李配婷，陳振玲

（1.連云港海關，江蘇連云港 222042；2.鹽城海關，江蘇鹽城 224002；3.貴州理工學院，貴州貴陽 550003）

喹諾酮類藥物是一類廣泛用于水產養殖的人工合成抗菌藥物，用來預防和治療動物疾病，具有廣譜、高效、價廉等特點[1?2]，但誤用、濫用等不合理使用喹諾酮類藥物不僅會使其在環境中殘留，還會對人體健康造成危害[3?5]。許多國家和地區、國際組織都對喹諾酮在水生動物和水產品中的殘留作出了規定。中國原農業部公告第2292號宣布停止生產用于食品動物的洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星4種原料藥的各種鹽、酯及其各種制劑。其他國家的要求也越來越高，如輸往韓國的養殖水產品中諾氟沙星、培氟沙星和氧氟沙星的限量要求不得檢出[6]。鲆鰈類魚一般指身體扁平，眼在頭部一側的鰈形目魚類，包括鰈科、鰨科和鲆科等，是我國重要的養殖海水魚類[7?8]，根據中國漁業統計年鑒2018年鲆魚和鰈魚養殖年產量分別為10.8萬噸和1.4萬噸[9]。水產品中的喹諾酮類藥物殘留量小，樣品基質復雜，需要高效的前處理和檢測技術，目前水產品中應用較多的前處理技術有液液萃取法[10?12]、固相萃取法[13?14]和QuEChERS法[15?16]等，而高效液相色譜-串聯質譜法的分析時間短、檢出限低、準確性和靈敏度高，是喹諾酮類藥物殘留檢測中應用較廣的儀器檢測方法[17?19]。

測量不確定度用來表征被測量值的分散性[20?21]，可以體現檢測結果的準確性和可靠性，測量不確定度的評定是食品檢測中質量控制的重要內容[22?23]。本文參考SN/T 1751.2-2007 《進出口動物源食品中喹諾酮類藥物殘留量檢測方法 第2部分：液相色譜-質譜/質譜法》建立了鲆鰈類水產品中我國已停用的4種喹諾酮類藥物殘留的檢測方法[24]，參照已經報道的動物源性食品中獸藥殘留檢測中的不確定度的評定方法[25?28]，對不確定度的來源分析和量化，為鲆鰈類水產品中喹諾酮類殘留檢測過程質量評價提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

諾氟沙星（norfloxacin, 純度≥99.6%）、培氟沙星（pefloxacin, 純度≥92.1%）、氧氟沙星（ofloxacin, 純度≥99.3%）、洛美沙星（lomefloxacin, 純度≥99.4%） 德國Dr. Ehrenstorfer公司；甲醇、乙腈（色譜純） 德國Merck公司；其他試劑 為國產優級純；實驗用水 為自制超純水；石鰈、星斑川鰈、半滑舌鰨等鲆鰈類樣品 采購自本地市場。

QTRAP 4500型液相色譜-串聯質譜儀，配備有電噴霧離子源（ESI） 美國AB SCIEX儀器公司；XS 205型分析天平 瑞士Metller Toledo公司；Milli-Q純水儀 美國Millipore公司；N-EVAP 112氮吹儀 美國Organomation公司。

1.2 實驗方法

參考SN/T 1751.2-2007《進出口動物源食品中喹諾酮類藥物殘留量檢測方法 第2部分：液相色譜-質譜/質譜法》中的前處理方法并改進。

1.2.1 標準溶液配制 200 mg/L標準儲備液：準確稱取經純度折算后為10 mg的標準物質，用甲醇溶解定容。

10 mg/L混合標準溶液：分別取適量單標儲備液用甲醇稀釋，使用前稀釋至所需濃度。

1.2.2 樣品前處理 稱取5.00 g制備均勻的樣品于50 mL塑料離心管中，加入10 mL含1%（V/V）乙酸的乙腈旋渦混勻后超聲提取10 min，3500 r/min離心5 min，取上清液到另一離心管中。重復提取一次，合并上清液。加入5 mL正己烷旋渦混合1 min，3500 r/min離心5 min后取乙腈層于氮氣流下吹干，用1 mL甲醇?0.1%（V/V）甲酸水溶液（1:9）溶解定容，過0.22 μm有機濾膜，儀器測定。

1.2.3 儀器條件

1.2.3.1 液相色譜條件 色譜柱：ACE UltraCore 2.5 Super C18柱（100 mm×2.1 mm，2.5 μm）；柱溫40 ℃；進樣量5 μL；流動相0.1%（V/V）甲酸水溶液和甲醇；流速0.3 mL/min；流動相梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

1.2.3.2 質譜條件 電噴霧離子源；正離子掃描、多反應監測模式；去溶劑溫度500 ℃；電噴霧電壓5.5 kV；入口電壓和碰撞室出口電壓分別為10、6 V；氣體均為高純氮氣；碰撞氣、氣簾氣、霧化氣、輔助氣壓力分別為41.4、207、345、345 kPa。4種喹諾酮類藥物質譜參數見表2。

表2 4種喹諾酮類藥物的質譜參數Table 2 Mass spectrometry parameters of 4 quinolones

1.2.4 數學模型 根據鲆鰈類水產品中喹諾酮類殘留的測定方法，待測物在樣品中的殘留量計算公式如下：

式中：X—樣品中喹諾酮的殘留量，μg/kg；c—喹諾酮的校準濃度，μg/L；V—定容體積，mL；fR—回收率校正因子，等于回收率的倒數；m—試樣溶液代表的樣品質量，g。

1.3 數據處理

喹諾酮類藥物的標準工作曲線和樣品含量采用MultiQuant軟件處理，文中數據平均值和標準偏差等采用Excel軟件處理，公式采用Microsoft公式編輯器軟件編輯。

2 結果與分析

2.1 不確定度的主要來源

根據數學模型，不確定度主要有以下幾方面：a.校準濃度的不確定度，包括標準物質純度、標準溶液配制、標準曲線擬合和高效液相色譜-串聯質譜儀等的不確定度；b.樣品質量的不確定度，主要是天平的校準的不確定度；c.定容體積的不確定度；d.回收率的不確定度，方法前處理過程復雜，步驟較多，采用對樣品添加回收對樣品處理過程的不確定度進行評定；e.隨機效應的不確定度，包括稱量的重復性、體積的重復性、液相色譜-串聯質譜儀的重復性等引入的不確定度等。詳見圖1。

圖1 鲆鰈類水產品中4種喹諾酮類藥物殘留不確定度來源Fig.1 Uncertainty sources for determination of 4 quinolones residues in flatfish

2.2 校準濃度的不確定度urel（c）

2.2.1 標準物質純度的不確定度urel（p） 喹諾酮標準物質純度（p）及擴展不確定度（Up）見表3，標準物質標準不確定度計算公式為相對不確定度計算公式為4種喹諾酮純度的相對不確定度計算結果見表3。

表3 標準物質的純度及不確定度Table 3 Purity and uncertainty of standard materials

2.2.2 標準儲備液配制的不確定度urel（s） 標準儲備液的配制過程參照標準，分別稱取按照純度折算相當于10 mg的喹諾酮標準物質，用甲醇溶解定容于50 mL容量瓶中，包括標準物質稱量的不確定度和50 mL容量瓶的不確定度。

a.標準物質稱量的不確定度urel（m1）

查詢天平的校準證書，其擴展不確定度為0.05 mg（k=2），則2次稱量過程（去皮和稱樣）產生的標準不確定度為：詳見表4。

表4 標準儲備液配制的不確定度Table 4 Uncertainty of standard stock solutions

b. 50 mL容量瓶的不確定度urel（V50mL）

根據JJG 196-2006《常用玻璃量器檢定規程》[29]，A級50 mL容量瓶的容量允差為±0.05 mL，按三角分布則標準不確定度為在20±5 ℃下操作，甲醇的體積膨脹系數為1.18×10?3，按均勻分布，則由溫度效應引入的體積標準不確定度為：則50 mL容量瓶的標準不確定度為：0.171mL，相對確定度為：

2.2.3 配制混合標準溶液的不確定度urel（ms）

a.10 mg/L混合標準溶液的配制引入的不確定度urel（10 mg/L）

移取5 mL 4種喹諾酮類標準儲備溶液至100 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容。A級單標線5 mL吸量管的容量允差為±0.015 mL，按三角分布，則u(V3)=

A級100 mL容量瓶的容量允差為±1 mL，按三角分布，則在20±5 ℃下操作，甲醇的體積膨脹系數為1.18×10?3，按照均勻分布則由溫度效應引入的體積標準不確定度

b.0.5 mg/L混合標準溶液的配制引入的不確定度urel（0.5 mg/L）

2.2.5 最小二乘法擬合標準曲線校準的不確定度urel（cal） 5個濃度標準系列溶液分別上機測定3次，以標準系列溶液的濃度（μg/L）為橫坐標，3次進樣定量離子對平均峰面積為縱坐標，采用最小二乘法擬合，得到線性回歸方程A=ac+b（a為斜率，b為截距）和線性相關系數r，結果見表6。

標準曲線的擬合標準偏差按照下列公式計算：

式中：ci為標準系列濃度，Ai為對應的峰面積，a為標準曲線斜率，b為標準曲線截距，n為標準系列溶液測定總次數（本實驗為5×3=15）。

樣品平行測定3次，根據標準曲線方程求得平均濃度。則擬合標準曲線的標準不確定度按下式計算：

式中：S（A）如前所述；a為斜率；p為測定次數，這里為3；n=15；c為樣品平均濃度為標準系列的平均濃度，這里為33.2 μg/ L；

由最小二乘法擬合標準工作曲線引入的相對不確定度計算結果見表6。

表6 標準工作曲線擬合的不確定度Table 6 Uncertainty of standard curve

2.2.6 高效液相色譜-串聯質譜儀的不確定度urel（LCMS） 查詢高效液相色譜-串聯質譜儀的校準證書，儀器的相對擴展不確定度為5.2%（k=2），則由高效液相色譜-串聯質譜儀引入的相對不確定度urel（MS）為0.026。

2.2.7 校準濃度的不確定度的合成 綜合以上各分量，得出校準濃度引入的不確定度計算公式：urel(c)=4種喹諾酮類藥物校準濃度的不確定度計算結果為：urel（c）氧氟沙星=0.0468；urel（c）培氟沙星=0.0522；urel（c）諾氟沙星=0.0649；urel（c）洛美沙星=0.0478。

2.3 樣品質量的不確定度urel（m）

稱樣量為5.00 g，電子天平的校準證書給出擴展不確定度為0.05 g（k=2），稱量2次（一次去皮，一次稱樣），標準不確定度和相對不確定度分別為：

表5 標準溶液配制的不確定度Table 5 Uncertainty of standard solution preparation

2.4 定容體積的不確定度urel（V）

2.5 回收率的不確定度urel（R）

2.6 隨機效應的不確定度urel（A）

隨機效應的不確定度包括由稱量、定容等過程中隨機效應不確定度的加和，為不確定度的A類評定，采用對同一樣品平行測定6次，計算其標準偏差，結果見表8。

表8 隨機效應的不確定度Table 8 Uncertainty of repeatability

2.7 合成不確定度

2.8 擴展不確定度及結果報告

表10 鲆鰈類水產品中4種喹諾酮類殘留測定不確定度評定結果Table 10 Uncertainty evaluation result for determination of 4 quinolones residues in flatfish

3 結論

本研究建立了測定鲆鰈類水產品中氧氟沙星、培氟沙星、諾氟沙星和洛美沙星殘留量過程中的不確定度評定方法，分析不確定度的來源并計算，得出擴展不確定度并報告了檢測結果。從評定結果看，不確定度的主要貢獻來自于標準曲線的擬合、高效液相色譜-串聯質譜儀和標準溶液配制，應當注意標準曲線的配制和保持儀器的良好狀況。不確定度的評定和分析對進出口鲆鰈類水產品中喹諾酮類藥物殘留檢測中的質量控制有參考意義。

表7 回收率的不確定度Table 7 Uncertainty of recoveries

表9 不確定度分量匯總表Table 9 Summary of each uncertainty component