金釵石斛提取物對便秘模型小鼠通便功能的影響

王微微，范紅結，楊文紅，夏開艷，黎華貴，李曉麗，王詩滿，張 艷

（1.遵義醫科大學基礎醫學院，貴州遵義 563000；2.南京農業大學動物醫學院，江蘇南京 210095；3.遵義醫科大學臨床學院，貴州遵義 563000；4.遵義醫科大學藥學院，貴州遵義 563000）

便秘是一種常見的胃腸功能性疾病，它在各個年齡段人群中普遍存在，主要表現為排便困難、排便頻率低、糞便量少、糞便干硬、排便費力以及整個消化道排空時間延長并且伴隨著腹脹和腹痛等癥狀[1]。全球人群的便秘患病率為2%~28%，在中國，便秘發病率為10%~15%，其中60歲以上的老年患者約占20%左右[2]，便秘的發生會嚴重影響患者的身心健康，多出現焦慮和抑郁等心理問題，這些精神心理問題又會影響胃腸運動功能，從而進一步地加重便秘癥狀，并且長期便秘也將加劇心腦血管疾病，嚴重影響人群的生活質量[3?4]。

目前，常用于便秘治療的西藥有瀉劑、促動力藥和微生態制劑等，這些藥物短期效果好，但長期應用會對腸道環境和功能造成影響，不易長期耐受，停藥后易復發[5?6]。中醫藥治療可根據患者個體差異進行辨證論治，著眼于整體、療效明確且標本兼治，具有副作用少、藥物依懶性小等優勢[7]，逐漸得到醫學界的重視。

金釵石斛（Dendrobium nobileLindl）為我國傳統名貴中藥，含有豐富的生物堿、酚類、多糖類等功能性成分。金釵石斛的莖為傳統中藥石斛的來源之一，為歷版中國藥典所收載，并且在中國藥典2010年版中被列為藥用石斛的首要來源，具有“強陰益精、厚腸胃、壯筋骨、暖水臟、補腎益力、輕身延年”的功效，能夠益胃生津，起到保護胃腸道等作用[8?9]。研究表明，金釵石斛的藥理作用主要表現在抗腫瘤、降血糖和保護神經系統等方面，也能夠明顯地促進胃酸分泌和改善腸道運動功能[10?13]，說明金釵石斛對胃腸道疾病的治療具有潛在的臨床應用價值。本研究通過構建小鼠便秘模型探討金釵石斛對小鼠通便功能的影響并初步地探討其可能的作用機制，以期為深入開發金釵石斛的臨床研究應用提供理論和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

清潔級昆明小鼠，雄性，4周齡，體質量（20±2）g，重慶醫科大學實驗動物中心，實驗動物生產許可證是SCXK（渝）2017-0001，本實驗符合遵義醫科大學實驗動物倫理委員會的倫理學標準。小鼠適應性喂養1周后進行實驗，實驗期間喂養于溫22~25 ℃的實驗動物房，自由供給標準飼料和清潔飲用水。

金釵石斛提取物 遵義醫科大學藥物分析教研室提供；復方地芬諾酯（含鹽酸地芬諾酯2.5 mg，硫酸阿托品25 μg，產品批號：17020801） 河南鼎昌藥業有限公司；柱式細菌基因組試劑盒 上海生工生物工程有限公司；PCR試劑、膠回收試劑盒和限制性內切酶SamI、HindIII、HhaI和RsaI 賽默飛世爾科技公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 藥物與制劑 金釵石斛提取物制備：以超純水為溶劑，按照一定的金釵石斛提取物濃度，金釵石斛干粉以料液比為1:20（g/mL），在溫度80 ℃條件下，分2次水浴提取，合并2次提取液，分裝待用。

活性炭懸液的制備[14]：阿拉伯樹膠50 g，加水400 mL后煮沸至溶液透明，加入活性碳25 g后繼續煮沸三次，冷卻至室溫后加水定容至500 mL，4 ℃保存，用前搖勻。

1.2.2 動物分組和給藥 將昆明小鼠隨機分成6組：正常組（Normal）、模型組（Model）和金釵石斛高、中、低劑量組（DNL-H、DNL-M、DNL-L；300、100和30 mg/kg；劑量選擇基于前期的劑量篩選實驗），每組12只。金釵石斛高、中、低劑量組灌胃給予相應濃度的藥物，正常組和模型組同時灌胃給予等量的生理鹽水。連續給藥7 d，期間自由飲食。

1.2.3 復方地芬諾酯便秘模型的建立 復方地芬諾酯建立小鼠便秘模型參照文獻[15]方法，末次給藥結束，各實驗組小鼠禁食不禁水16 h，除正常組外，其余實驗組灌胃給予復方地芬諾酯（10 mg/kg），正常組灌胃給予等量生理鹽水。灌胃復方地芬諾酯0.5 h后造成便秘模型。

1.2.4 金釵石斛提取物對便秘小鼠排便的影響 便秘小鼠模型造模后0.5 h后，取各試驗組每組小鼠6只，灌胃0.2 mL活性炭懸液，從灌胃活性炭懸液開始，觀察和記錄各實驗組小鼠首次排除黑便的時間，連續觀察6 h，并記錄6 h內的小鼠排便顆粒數量；收集6 h內的小鼠糞便，稱重記錄為糞便濕重，隨后將糞便置于65 ℃烘箱內干燥24 h，稱重記錄為糞便干重，計算小鼠糞便含水量，即糞便濕重和干重的差值與糞便濕重的比值。

1.2.5 金釵石斛提取物對便秘小鼠腸蠕動的影響造模后0.5 h后，取各試驗組每組小鼠6只，按照1.2.4方法，活性炭懸液灌胃25 min后，將小鼠脫頸處死，剪取上端幽門至下端回盲部的腸管，平鋪于玻璃板上拉成直線，測量小腸總長度以及從幽門至墨汁前端的“墨汁推進長度”，計算小腸推進率，即墨汁推進長度與小腸總長度的比值。

1.2.6 糞便的采集和宏基因組DNA的提取 造模成功后，收集各組小鼠的糞便，同組每2只小鼠的糞便收集在一起，于2 mL無菌離心管中，每組共6只小鼠，3個重復，?80 ℃保存。小鼠糞便菌群宏基因組提取按照DNA抽提試劑盒說明書完成總DNA提取，采用微量紫外分光光度計測定其質量濃度[16]，?20 ℃保存備用。

1.2.7 乳酸桿菌特異引物PCR及膠回收 以提取的糞便細菌宏基因組DNA為模板，采用乳酸桿菌特異性引物[17]7f [引物序列為5′-AGAGTTTGAT（C/T）（A/C）TGGCTCAG-3′]和LAB-rev（引物序列為5′-CTCAAAACTAAACAAAGTTTC-3′）進 行PCR擴增。PCR反應體系為：2×PCR mix 25 μL，終濃度為0.5 μmol/L，上、下引物（10 μmol/L）各2 μL，模板2 μL，ddH2O補足至50 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min；94 ℃ 45 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環35次；72 ℃最終延伸10 min。PCR產物置于1%瓊脂糖凝膠電泳并凝膠成像儀觀察分析，并用PCR產物回收試劑盒純化產物。

1.2.8 擴增核糖體限制性酶切片段分析 PCR純化產物用限制性內切酶SamI、HindIII、HhaI和RsaI酶切，酶切體系為：PCR產物10 μL，四種內切酶各2 μL，10×Buffer 2 μL，ddH2O 12 μL；37 ℃恒溫反應4 h后，經1%瓊脂糖凝膠電泳并凝膠成像儀觀察分析，利用Image lab 5.0軟件進行處理并分析。

1.3 數據分析

ARDRA電泳圖譜采用NTSYS軟件進行UPGMA聚類分析。采用Shannon-Wiener多樣性指數、Simpson指數和Pielou均勻度指數分析各組小鼠糞便中乳酸桿菌的多樣性特征[18]。采用SPSS20.0軟件對相關數據統計分析，組間比較采用LSD法進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 金釵石斛對便秘小鼠排便及腸蠕動的影響

觀察各組小鼠首粒黑便排出時間以及6 h內排出糞便顆粒數后，結果顯示，與正常組比較，模型組小鼠的黑便首次排出時間顯著地增加（P<0.01）且排出糞便的含水量顯著地降低（P<0.01）；與模型組比較，各個金釵石斛提取物給藥組的首次排黑便時間顯著降低（P<0.01），排出糞便顆粒數有增加的趨勢，并且糞便含水量顯著地增加（P<0.01），見表1。

經測量和計算各組小鼠的小腸推進率，結果顯示，與正常組比較，模型組小鼠的小腸推進率顯著地降低（P<0.05），結合黑便首次排出時間顯著增加以及糞便含水量顯著降低的現象，表明小鼠的便秘模型建模成功；與模型組比較，金釵石斛提取物給藥低劑量組小鼠的小腸推進率有所升高，隨著劑量增加呈升高的趨勢，金釵石斛提取物給藥高、中劑量組小鼠的小腸推進率顯著升高（P<0.05），見表1。

表1 各組小鼠6 h的排便情況和小腸推進率（xˉ±s，n=6）Table 1 Defecation and intestine pushing rate of mice with different treatment for 6 h (xˉ±s, n=6)

2.2 糞便菌群宏基因組的乳酸桿菌ARDRA分析

各組小鼠糞便菌群宏基因組DNA經乳酸桿菌特異性引物PCR擴增后，用限制性內切酶SamI、HindIII、HhaI和RsaI對PCR純化產物進行酶切，酶切產物經1%瓊脂糖凝膠電泳并采用Image lab 5.0軟件進行條帶分析，酶切條帶的大小在100~1000 bp之間，結果見圖1。根據ARDRA的酶切產物帶型劃分不同的操作分類單元（operational taxonomic units，OTUs），將每一個限制性片段長度多態性類型歸為一個OTU，其中小于100 bp的片段以及模糊片段在本研究中不計數。結果顯示（見表2），正常組、模型組和金釵石斛提取物低劑量組為6個OTUs，金釵石斛提取物中、高劑量組均為7個OTUs。酶切條帶數量反映菌群多樣性的高低，酶切條帶信號強弱表明該物種數量的多少。與模型組和正常組相比，金釵石斛提取物灌胃各組在100~250、250~500和250 bp處的條帶整體數量較多，且信號較強，其中高劑量組在100~250 bp處有1條較為明顯的條帶。

表2 各組小鼠糞便中乳酸桿菌的多樣性分析Table 2 Diversity analysis on Lactobacillus in fecal microbiota from mice with different treatment

圖1 各組小鼠糞便中乳酸桿菌的ARDRA分型結果Fig.1 ARDRA fingerprint profiles of the Lactobacillus in fecal microbiota from mice with different treatment

2.3 金釵石斛提取物對乳酸桿菌多樣性指數的影響

采用α多樣性分析來反映各組小鼠腸道中乳酸桿菌的群落結構，通過Shannon-Wiener和Simpson多樣性指數反映細菌群落中物種的多樣性，兩者的數值越大，表示細菌群落多樣性越高。從表2可以看出，較其它各組小鼠，模型組小鼠的腸道中乳酸桿菌的多樣性指數（Shannon-Wiener和Simpson指數）以及Pielou均勻度指數均下降，表明小鼠腸道中乳酸桿菌多樣性下降，與乳酸桿菌的種類不均勻性有關；經過不同濃度金釵石斛灌胃后，小鼠腸道中乳酸桿菌的多樣性指數和均勻度指數較模型組升高；整體上看，隨著金釵石斛濃度的升高，小鼠腸道中乳酸桿菌的多樣性增加，高劑量組小鼠腸道中乳酸桿菌的種類組成均勻度更穩定。

2.4 各組小鼠糞便乳酸桿菌聚類分析

根據各組小鼠糞便乳酸桿菌的ARDRA電泳圖譜，構建0/1矩陣，對其進行UPGMA聚類分析，結果如圖2所示。從聚類圖可以看出，在相似性系數為0.75時，各組小鼠糞便乳酸桿菌群落結構可分為兩大類，其中模型組（Model_2除外）聚為一類，正常組及金釵石斛各劑量組（DNL-L_3和DNL-M_3除外）聚為一類，說明便秘造模使得未經金釵石斛灌胃的小鼠腸道中乳酸桿菌群落結構發生了改變，而經金釵石斛各劑量組作用，小鼠腸道中乳酸桿菌群落結構受到造模的影響小，接近正常組水平。

圖2 各組小鼠糞便中乳酸桿菌的ARDRA圖譜的聚類分析Fig.2 Cluster analysis based on ARDRA patterns of the Lactobacillus in fecal microbiota from mice with different treatment

3 討論

現今便秘患病率呈現逐年上升的趨勢，副作用少且有療效的治療藥物顯得尤為重要[19]。在本實驗中，觀察了金釵石斛提取物對復方地芬諾酯造成便秘小鼠模型的便秘改善情況，結果顯示，6 h內金釵石斛提取物各劑量組小鼠的排出糞便顆粒數較模型組增多，并且與正常組相似；在首次排黑便時間及糞便含水量的兩項指標上，各劑量組均極顯著地高于模型組；同時，較模型組而言，金釵石斛提取物各劑量組小鼠的小腸推進率均增高，并且隨著提取物使用劑量的增加，小腸推進率的改善作用更加顯著。由此可見，金釵石斛提取物同樣地是通過潤腸和促進胃腸運動而發揮其改善便秘的作用[20]。

便秘是多因素共同引起的一種疾病，除了結腸運動、生活方式等主要因素外，腸道微生物的微生態紊亂在便秘的發生發展過程中也起到了重要的作用。研究發現便秘人群的腸道微生物群落特征存在著差異性，其中某些特定菌群的組成和數量發生了改變[21?23]。在對昆明小鼠的糞便菌群分析時，發現乳酸桿菌是健康小鼠腸道菌群的優勢菌群，但是在便秘小鼠腸道菌群中的比例表現出快速下降的趨勢[24]。乳酸桿菌廣泛地存在于人體的胃腸道中，可以通過產生有機酸等酸性代謝物，使腸道內環境中pH降低，刺激腸道蠕動，改善便秘癥狀[25?26]；也可以降低小腸的移行性肌電復合波（MMC）而加速小腸轉運等[27?28]，說明腸道中乳酸桿菌能夠影響腸道傳輸能力，與便秘的發生存在相關性。

本實驗中各組小鼠糞便中微生物基因組經乳酸桿菌特異性引物PCR后，經多酶切后采用ARDRA進行分析，結果顯示模型組小鼠腸道中乳酸桿菌的多樣性和均勻度指數均較其它各組下降，聚類分析也顯示了類似的結果，同時，結合模型組小鼠黑便首次排出時間顯著增加并且小腸推進率顯著地降低等情況，說明由于胃腸道動力的改變影響了胃腸道中微生物群落結構，從而造成提示了小鼠腸道中乳酸桿菌組成的改變[29]。已有研究發現鐵皮石斛能夠促進腸道菌群中益生菌的增加，顯著地增加了乳酸桿菌和雙歧桿菌的數量[30?31]。在本實驗中，與模型組相比，經不同濃度的金釵石斛提取物灌胃后的小鼠，其腸道中乳酸桿菌的多樣性和均勻度指數均升高，且高劑量組小鼠腸道中乳酸桿菌的菌群均勻度指數最高，說明高劑量的金釵石斛提取物作用后的小鼠腸道中乳酸桿菌群落結構較為穩定，提示了金釵石斛提取物對小鼠便秘改善作用與調節腸道中乳酸桿菌有關。

本實驗發現金釵石斛提取物能夠改善小鼠便秘癥狀且能夠改變小鼠腸道中乳酸桿菌的多樣性，并且多樣性指數隨著藥物濃度升高而增加，提示金釵石斛可能是通過調節腸道內乳酸桿菌的菌群組成而發揮其對小鼠便秘的改善作用。由于腸道微生物群落組成復雜，今后研究還需要綜合地分析腸道微生物群落多樣性及其代謝產物，以更加全面地從微生物組學以及代謝等方面認識金釵石斛改善便秘的作用機制，為進一步地開發金釵石斛的藥用價值和臨床應用奠定基礎。