小麥MYB轉錄因子家族的生物信息學分析

黃建國，張超群，張 馳，卞云迪，劉曉穎，范寶莉，王振英

（1.天津師范大學生命科學學院，天津300387；2.天津師范大學天津市動植物抗性重點實驗室，天津300387）

MYB（v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog）家族是植物中最大的轉錄因子家族之一，根據其蛋白重復結構域數量可分為1R-MYB、R2R3-MYB、3R-MYB、4R-MYB等4類，其中大多以R2R3-MYB類存在[1].Dubos等[2]最早在玉米中發現了MYB轉錄因子ZmC1，該因子參與調控玉米中花青素的合成.與動物和酵母中的轉錄因子相比，植物中MYB轉錄因子在結構和功能上的保守性更高[3-5].MYB轉錄因子家族成員很多，具有非常復雜的功能，如參與信號轉導[6-7]、抵御病原菌[8]、參與木質部發生和木質素合成[9-11]等生物過程，同時也參與調控植物的生理代謝，尤其是次生代謝物如花青素、類黃酮等物質的合成[12].在植物應對干旱脅迫、鹽脅迫等非生物脅迫的調控中MYB轉錄因子亦具有重要作用[13-16].除擬南芥外，MYB轉錄因子家族的全基因組特性在水稻、玉米、谷子、大豆、橙子和蘋果中均已完成[17].小麥（Triticum aestivum）是全球最重要的農作物之一，由于小麥基因組龐大，目前對小麥MYB家族基因的研究仍相對較少.基因組測序的完成極大促進了小麥功能基因的研究.如Zhang等[18]發現一個1R-MYB轉錄因子TaLHY在小麥葉、穗、莖中表達量較高，而在根中表達量較低.因此對小麥MYB轉錄因子家族開展生物信息學分析，對進一步了解MYB的功能具有重要意義.

本研究采用生物信息學方法，對小麥MYB家族基因進行全基因組鑒定，并用鑒定到的小麥、二穗短柄草（Brachypodium distachyon）、大麥（Hordeum vulgare）MYB基因家族成員，對基因結構、保守結構域、順式作用元件及物種共線性等進行分析，為深入研究小麥MYB轉錄因子家族以及小麥品質改良提供參考.

1 材料與方法

1.1 小麥MYB基因家族成員鑒定與序列特征分析

從Ensembl Plants數據庫（http：//plants.ensembl.org/index.html）中下載小麥的全基因組序列.在Pfam（http：//pfam.xfam.org）中下載MYB基因特有的保守結構域模型（PF00249），利用該模型在小麥蛋白數據庫中進行Blast p比對，得到候選基因，再次將這些候選基因提交到Hmmer、NCBI-CDD等在線網站進行保守域的結構驗證，最終得到小麥MYB基因.利用在線工具ExPASy（http：//web.expasy.org/protparam/）預測小麥MYB轉錄因子家族成員的等電點（pI）、蛋白相對分子質量（pW）、氨基酸長度和染色體定位信息等屬性，使用CELLO V.2.5（http：//cello.life.nctu.edu.tw/）在線網站進行亞細胞定位.

1.2 預測保守motif和基因結構

通過在線數據庫MEME（http：//meme-suite.org/）預測小麥MYB基因家族成員的保守結構域.使用WebLogo（http：//weblogo.berkeley.edu/）默認設置獲取序列標識進行基因結構分析.

1.3 繪制順式作用元件

利用TBtools工具截取小麥MYB基因家族成員上游1 500 bp基因序列，并通過PlantCare（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）對順式作用元件進行分析.

1.4 小麥MYB基因家族物種共線性

將小麥基因組、二穗短柄草基因組、大麥基因組通過MCScanX進行物種間共線性分析.并利用TBtools繪制小麥、二穗短柄草、大麥基因組物種間MYB基因家族成員的共線性圖譜.

2 結果與分析

2.1 小麥MYB基因家族成員理化性質的預測

通過2次比對搜索，最終得到了76個小麥MYB轉錄因子基因，并根據基因的同源關系將其重命名.對小麥MYB基因編碼的蛋白質的理化性質分析結果如表1所示.

表1 小麥MYB基因家族的基本信息Tab.1 Basic information of MYB gene family in wheat

續表

由表1可以看出，氨基酸個數最多的是1號，有856個氨基酸殘基，最少的是24號，有204個氨基酸殘基；相對分子質量為23.15×103～94.90×103；理論等電點（pI）介于4.75（56號基因蛋白）～11.39（24號基因蛋白）之間.利用CELLO在線網站進行亞細胞定位分析發現，小麥MYB轉錄因子家族成員的基因均能定位于細胞核，其中7個基因可同時定位于其他細胞器上（14、15、29、30、51、59和70號基因）.

2.2 保守motif和基因結構分析

對小麥的76條MYB轉錄因子的氨基酸序列進行多序列比對并構建系統進化樹，結果如圖1（a）所示.利用在線軟件MEME對TaMYBs蛋白進行保守基序搜索，并利用TBtools軟件結合進化樹進行可視化分析，結果如圖1（b）和圖1（c）所示.通過MEME程序共獲得了9個保守結構域，親緣關系近的不同亞類蛋白較為保守，組成motif較為相似；同一分枝的TaMYBs蛋白具有相似的motif組成，不同進化分枝的motif組成存在差異，而保守基序的差異可能是基因之間存在功能分化的重要原因.本研究鑒定出的TaMYBs蛋白都具有MYB家族的保守結構域，且大多數的保守結構域位于MYB蛋白的N端，表明這些motif對MYB蛋白行使其功能特別重要.總之，聚在同一組的蛋白成員其motif的組成是相同的，預示同一組的不同成員其功能有可能相同.

圖1 小麥MYB基因的分析Fig.1 Analysis on MYB genes in wheat

小麥MYBs基因家族大多數成員都有內含子，數目由0到11個.其中MYB118-like基因結構最復雜，外顯子數目最多為11個，內含子數目為11個，而MYB56-like基因結構簡單，均只含有1個外顯子和0個內含子.進化樹上聚在一起、親緣關系較近的MYB基因家族成員具有相同的基因結構，內含子的數目、位置和外顯子長度相同.如MYB4和OsMYB1-like、MYB33和MYB30-like這2對同源基因對，外顯子數分別為1個和2個，內含子數分別為1個和0個，其同源基因的外顯子、內含子的長度和位置都相同.MYB27-like、MYB102-like、MYB80-like和MYB80在進化樹上聚到一起，都具有3個外顯子和2個內含子.由此可見，小麥MYBs內含子長度、外顯子位置和數目在不同成員之間都存在差異，說明小麥MYB家族在進化過程中產生了較強分化.

2.3 對小麥MYB基因家族成員順式元件的分析

為了探究小麥MYB基因家族成員對激素、生物和非生物脅迫相關的調控作用，利用小麥MYB基因上游1 500 bp的基因組序列分析MYB基因順式作用元件.在MYB基因家族中鑒定到多種響應環境和激素信號的順式作用元件，如圖2所示.

由圖2可以看出，小麥MYB基因家族的表達調控機制較為復雜，其中，90.79%家族成員均具有脫落酸響應的相關調控元件，55.26%家族成員具有赤霉素響應的相關調控元件，48.68%家族成員具有生長素響應的相關調控元件（如MYB108受到生長素反應因子調控使得花藥開裂），53.94%的家族成員具有水楊酸響應元件，72%的家族成員含有MeJA響應的結合位點，61.84%的家族成員具有參與DNA光響應的元件，50%以上的成員具有光模塊調控元件，51.31%的家族成員具有厭氧誘導響應元件（如MYB44的顯性抑制可引起氧化損傷和對非生物脅迫的超敏反應），36.84%的家族成員含有響應干旱誘導的MYB轉錄子結合位點（如MYB1與干旱響應誘導相關），34.21%基因家族成員含有低溫響應的相關調控元件.除鑒定到參與干旱、低溫等逆境損傷外，還鑒定到參與傷口響應元件MYB120-like.參與細胞周期調控的只有7個相關元件，包括MYB109-like、PHL7-like、SM153-1like、APL-like、PHR33x1-like、MYB69-like和MYB75-like.參與晝夜節律控制的順式作用調控元件只有MYB108-like.以上分析表明，小麥MYB基因家族成員在激素調控、逆境響應和光響應過程中發揮著重要作用.

2.4 物種共線性分析

對大麥、小麥、二穗短柄草的共線性進行分析，結果如圖3所示.由圖3可以看出，大麥與小麥之間共線性有44對，小麥與二穗短柄草之間共線性有46對，有28個基因在三者之間存在共線性，說明這些基因可能在進化上更保守.分析基因結構，28個基因中有20個R2R3-MYB類型基因和8個1R-MYB類型基因.

圖3 大麥、小麥、二穗短柄草的共線性Fig.3 Collinearity of barley，wheat and two-spike short-stalk grass

對小麥轉錄因子家族內基因的共線性進行分析，結果如圖4所示.由圖4可以看出，有53個基因家族成員呈現出共線性，其中3B上最多的有5個成員，5B上則沒有分布，說明小麥MYB轉錄因子家族基因在染色體進化中呈現不均勻分布，不斷地進行串聯復制，從而擴大了小麥基因組.

圖4 小麥MYB家族物種內的共線性Fig.4 Collinearity within the MYB family of wheat

對存在共線性的28個共有基因（表2）進行順式作用元件分析（圖2）.其中，26個基因參與光響應元件，19個基因參與厭氧誘導響應元件，7個基因參與干旱誘導結合位點的元件，4個基因參與種子特異性調控元件，1個基因參與晝夜節律控制的順式作用調控元件，1個基因參與細胞周期調節的順式作用元件.另外，還有參與激素響應的相關元件，包括有24個基因參與茉莉酸響應元件，23個基因參與脫落酸響應元件，16個基因參與赤霉素響應的元件，15個基因參與水楊酸響應元件，10個基因參與生長素響應元件.這說明每個基因都有自己的主要功能，同時又對其他元件起著輔助作用.

表2 小麥28個MYB基因家族成員信息Tab.2 Information of 28 MYB gene family members in wheat

3 討論與結論

本研究利用生物信息學技術對小麥基因組中的MYB轉錄因子進行了全基因組鑒定，并對所有家族成員進行了系統的生物信息學分析.經鑒定得到了76個小麥MYB轉錄因子基因，分布在1～7染色體上.小麥MYB轉錄因子家族的蛋白長度為204～856個氨基酸殘基，相對分子質量為23.14×103～94.91×103，等電點范圍為4.75～11.39.蛋白亞細胞定位分析表明，TaMYBs蛋白均可以定位在細胞核中.親緣關系相近的轉錄因子通常有相似的基因結構組成，如MYB4和OsMYB1-like、MYB33和MYB30-like.小麥MYBs轉錄因子家族保守基序較多且較為復雜，具有多種多樣的生物學功能.小麥MYB轉錄因子家族成員基因啟動子順式作用元件種類較多，包括與小麥光響應相關的順式作用元件和與激素應答相關的順式作用元件[19].所有的小麥MYB基因家族成員均含有光響應順式作用元件，并含有不同的激素響應順式作用元件，如脫落酸、茉莉酸、水楊酸、赤霉素和生長素順式作用元件[20-22].同樣，TaMYBs基因啟動子序列也包含了其他大量與逆境脅迫響應相關的順式作用元件[23-25].意味著該家族成員參與信號通路的能力及生物學功能可能不同，這也有利于奠定抗性育種的資源基礎.通過對大麥、小麥、二穗短柄草三者之間的共線性分析可知，有28個基因在三者之間存在共線性，說明這28個基因在進化上更為保守，其中R2R3-MYB類型的基因有20個，說明R2R3-MYB保守性較強，這與在多種植物中的研究結果較接近[26].

植物中MYB轉錄因子家族的功能多樣，不同成員的功能及作用方式不盡相同.因此，開展MYB轉錄因子功能和作用機制的研究十分重要.植物中部分MYB轉錄因子家族成員已經有了較為廣泛的研究，接下來可以利用基因克隆、蛋白質功能分析的相關技術，進一步研究MYB轉錄因子在小麥的遺傳進化、生長發育和脅迫應答過程中的調控機制.本研究系統分析了小麥MYB基因家族的定位、基因結構及順式作用元件等，為今后研究該家族提供了參考.