2株肺炎克雷伯菌肌尾噬菌體的鑒定

高云航，張紅偉，馬紅霞，么乃全，徐鳳宇

(1.吉林農業大學動物科學技術學院，吉林 長春 130118；2.動物生產及產品質量安全教育部重點實驗室，吉林 長春 130118)

肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)是人和動物的共生菌，部分菌株致肺炎、敗血癥、子宮內膜炎等疾病；高毒力肺炎克雷伯菌(HypervirulentK.pneumoniae，hvKp)除引起社區獲得性肺炎(Community-acquired pneumonia，CAP)外[1]，也引起伴有轉移膿毒性病變和其他化膿性膿腫和肝膿腫[2]，其所致醫院獲得性肺炎(Hospital-acquired pneumonia，HAP)的28 d病死率達39.6%[1]。莢膜多糖是肺炎克雷伯菌的重要毒力因子，K1、K2、K5、K20、K54和K57等莢膜型與社區化膿性感染相關[3]。隨著抗生素使用量的增長，肺炎克雷伯菌呈現明顯耐藥現象[4]，加劇了控制該菌感染的難度。為緩解細菌耐藥性蔓延，開發補充或替代抗生素的抗菌劑用于防治細菌感染已成當務之急。

毒性噬菌體除復制后具有特異殺菌作用外[5]，其產生的解聚酶可清除莢膜、生物被膜、減弱細菌的毒力[6-7]。Wang等表達并純化了vB_KpnP_IME321株噬菌體的莢膜解聚酶Dp4，用其預處理實驗小鼠，在致死量宿主菌Kp409株K.pneumoniae感染后，實驗小鼠全部存活，感染宿主菌后口服該酶，實驗小鼠存活率顯著提高[6]。噬菌體或脂質體攜帶的雞尾酒噬菌體可保護所有肺炎克雷伯菌感染的BALB/c小鼠[8]。更可喜的是，肺炎克雷伯菌K7株噬菌體GH-K3的抗性突變株K7RR毒力遠低于K7株[9]。可見噬菌體及其相關有效成分非常有希望成為潛在的新型抗菌劑。本研究以分離自豬子宮內膜炎的肺炎克雷伯菌為宿主，分離毒性噬菌體，在鑒定基礎上檢測了其主要生物學特性，為更深入研究和應用肺炎克雷伯菌噬菌體提供資料。

1 材料與方法

1.1 菌株 豬源肺炎克雷伯菌KL1株、KL2株、KL3株、KL4株、KL5株、KL6株、KM1株和KM2株分離自肺炎患豬，414株、KE1株、KE2株、KE3株、KE4株和KE5株分離自子宮內膜炎患豬，共14株，均由本實驗室鑒定并保存。

1.2 主要試劑與儀器 上層LB半固體培養基、下層LB固體培養基、2×LB培養液、SM液等依標準方法配制。CP100MX超速離心機為日本日立公司產品；TEM-100CX透射電鏡為日本TEOLLTD公司產品。

1.3 方法

1.3.1 宿主菌篩選 復蘇分離自子宮內膜炎患豬的6株肺炎克雷伯菌，挑單菌落于LB液體培養基中培養過夜，分別取150 μL涂于LB平板，靜置后將頭孢噻肟等12種藥敏紙片貼于平板上，大腸桿菌ATCC25922株作質控菌株，培養16 h后觀察，根據動物源及人醫臨床實驗室標準化研究所(CLSI)細菌藥敏試驗標準[10-11]評估。

1.3.2 噬菌體分離、純化 以篩選的多重耐藥肺炎克雷伯菌為宿主，將采自長春市某豬場、牛場健康豬、牛的新鮮糞便的新用生理鹽水懸浮，靜置后取上清8 000 r/min離心20 min，取0.22 μm濾器過濾后濾液10 mL加10 mL 2×LB液體培養基中，加入新培養的宿主菌、CaCl2溶液(終濃度1 mmol/L)，100 r/min培養8 h。

噬菌體富集：離心培養液取上清過濾，如前述方法富集4次后再離心，過濾得噬菌體原液。

點滴法驗證原液：將80 μL新培養宿主菌涂于LB平板，靜置20 min，滴5 μL噬菌體原液，培養12 h觀察結果。

純化噬菌體：取100 μL稀釋噬菌體原液，與100 μL新培養的宿主菌液、CaCl2濃縮液混勻，室溫靜置15 min，加入5 mL 50 ℃上層LB培養基，混勻后速傾于下層LB平板上，37 ℃培養12 h。用滅菌牙簽挑取相對大而透明的單斑于1 mL SM液中，4 ℃ 冰箱中靜置12 h，離心、稀釋再鋪雙層平板，重復多次，純化噬菌體。

1.3.3 噬菌體裂解譜測定 以宿主菌外的13株肺炎克雷伯菌為受試菌，參考1.3.2中點滴法操作。

1.3.4 透射電鏡觀察 取稀釋的純化噬菌體，培養成噬菌斑網，加入3 mL SM液，4 ℃冰箱中過夜，吸出噬菌體，12 000 r/min離心20 min，取上清滴于銅網上，靜置1 min，2%磷鎢酸負染90 s，透射電鏡觀察。

1.3.5 氯仿、乙醚敏感性試驗 (1)氯仿敏感性試驗：將950 μL噬菌體與50 μL氯仿混勻，設對照組，4 ℃冰箱過夜，測效價。(2)乙醚敏感性試驗：將800 μL噬菌體與200 μL乙醚混勻，設對照組，冰浴振蕩2 h，3 000 r/min離心15 min，取水相測效價。

1.3.6 熱及酸堿穩定性試驗 設7個水浴溫度(40～ 70 ℃，間隔5 ℃)，分別放入盛1 mL噬菌體的EP管，作用20、40 min和60 min后分別取300 μL，冷卻測效價。

分裝900 μL pH 3～13的液體LB，37 ℃預熱，分別加入100 μL噬菌體，混勻，37 ℃培養3 h，測效價。

1.3.7 最佳感染復數測定 將活菌計數的宿主菌與已知效價的噬菌體按表1稀釋并等量混勻，于37 ℃搖床中培養5 h，4 ℃、12 000 r/min離心30 min，取上清過濾測感染復數(Multiplicity of infection,MOI)。

1.3.8 一步生長曲線繪制 按最佳MOI混勻噬菌體與宿主菌，37 ℃水浴中靜置15 min，4 ℃、12 000 r/min 離心1 min，棄上清，用液體LB懸浮、洗滌沉淀2次，加37 ℃預熱液體LB，37 ℃ 50 r/min培養，每10 min取500 μL，4 ℃、12 000 r/min離心20 min，取上清測效價，以效價的對數為縱坐標，以感染時間為橫坐標繪生長曲線。

2 結果

2.1 宿主菌篩選 由藥敏試驗知肺炎克雷伯菌414株僅對頭孢唑啉、頭孢噻肟、新霉素和阿奇霉素敏感，對諾氟沙星、阿米卡星、慶大霉素、卡那霉素、四環素、多西環素等耐藥，為6株試驗菌中抗菌譜最寬者，選為宿主菌。

2.2 噬菌體分離純化 經多次分離，從新鮮健康豬糞、牛糞中各得到1株噬菌體，分別經4次挑單斑純化，得邊緣整齊、透亮的均一噬菌斑(封底彩版圖1)，命名為KP1、KP2。

圖1 噬菌體KP1、KP2純化后噬菌斑Fig.1 The plaques of phage KP1,KP2 after purification

2.3 噬菌體裂解譜測定 檢測表明，KP1不裂解13株受試菌，KP2可裂解KL6株，裂解率分別為7%、14%，說明2株噬菌體特異性較強。

2.4 噬菌體電鏡觀察 透射電鏡觀察到KP1、KP2均呈蝌蚪狀復合對稱，有正二十面體頭部、可收縮尾，可見尾板，屬肌尾噬菌體科；KP1頭長寬(78±1.5)nm，尾長(109±2)nm；KP2頭長寬(72.92±3.81)nm，尾長(96.68±5.22)nm(封底彩版圖2)。

圖2 噬菌體KP1、KP2電鏡圖(40.0 k×)Fig.2 Electron micrograph of phage KP1,KP2 (40.0 k×)

2.5 氯仿、乙醚敏感性試驗 KP1、KP2經氯仿作用后，效價分別為6×108PFU/mL、1.06×109PFU/mL，經乙醚作用后效價分別為1.69×108PFU/mL、1.56×108PFU/mL，與對照組效價(KP1為9.2×108PFU/mL、KP2為5×108PFU/mL)差異不顯著。說明噬菌體KP1、KP2對乙醚和氯仿不敏感，推測其無囊膜。

2.6 熱及酸堿穩定性試驗 熱穩定性結果見封底彩版圖3，KP1、KP2在40～60 ℃時，效價變化不明顯，70 ℃作用20 min以上時，二者被滅活。

圖3 噬菌體KP1、KP2的熱穩定性Fig.3 Thermal stability of phage KP1,KP2A：KP1；B：KP2

KP1在pH 5～11條件下效價變化不明顯，對pH 4和12的環境也有一定耐受性，在強酸或強堿環境中(pH≤3或≥13時)被滅活；KP2在pH 4～10的環境下效價基本穩定，對pH 3和11的環境有較好耐受性，在強酸或堿環境下(pH≤2或≥12時)被滅活(圖4)。

圖4 噬菌體KP1、KP2的pH穩定性Fig.4 pH stability of phage KP1,KP2A：KP1；B：KP2

2.7 噬菌體的最佳MOI測定 當MOI為0.1時，噬菌體KP1效價為1.6×109PFU/mL；MOI為0.01時，KP2效價為1.05×109PFU/mL，分別為7個MOI中最高值，為最佳MOI(表1)。

2.8 噬菌體的一步生長曲線 繪制噬菌體KP1、KP2的一步生長曲線(圖5)，發現其繁殖規律圖像分別基本符合四次函數y=0.000 4x4-0.016x3+0.212 9x2-0.606 5x+4.770 8和三次函數y=-0.003 8x3+0.100 1x2-0.400 8x+4.731 1。KP1、KP2的潛伏期分別為20 min、30 min，爆發期分別約60 min、80 min，爆發量分別約為15 PFU/cell、11 PFU/cell。

圖5 噬菌體KP1、KP2的一步生長曲線Fig.5 One-step growth curve of phage KP1,KP2A：KP1；B：KP2

3 討論

近年來，隨著對肺炎克雷伯菌耐藥現象的關注，能裂解該菌的噬菌體也被廣泛關注和研究。Gao等[12]從北京某醫院廢水中分離到KN2莢膜型肺炎克雷伯菌的毒性、短尾噬菌體vB_KpnP_IME337，潛伏期為10 min，基因組為44 266 bp；Morozova等[13]報道了多重耐藥肺炎克雷伯菌短尾噬菌體KP8基因組為73 679 bp；Tan等[14]從上海某醫院分離了ST11型產碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌(Carbapenem-resistantKlebsiellapneumoniae，CRKP)的短尾噬菌體117和31；Shi等[15]分離CRKP的毒性、短尾噬菌體kpssk3，潛伏期也為10 min，可裂解受試27株CRKP臨床分離株，在溫度和pH改變時穩定性較好，基因組為40 539 bp；短尾噬菌體vB_KpnP_KL106-ULIP47 和vB_KpnP_KL106-ULIP54由Thiry等[16]分離；Cai等[17]從醫院污水分離的長尾噬菌體vB_KpnS_GH-K3(簡稱GH-K3)的爆發量為291 PFU/cell，在pH 6～10和50 ℃以下穩定，基因組為49 427 bp；長尾噬菌體TSK1有狹窄宿主譜，在pH 7和37 ℃下穩定，基因組為49 836 bp[18]；ZCKP1是從埃及Giza市的淡水中分離的肌尾噬菌體，基因組為150.9 kb[19]；噬菌體vB_Kpn_F48也屬于肌尾噬菌體科，對溫度和pH變化高度穩定，基因組為171 kb[20]。本試驗從健康豬、牛糞中各分離到1株 毒性、無囊膜肌尾噬菌體，裂解譜較窄，在40～60 ℃、pH 4～11的條件下穩定性較好，與kpssk3、TSK1、vB_Kpn_F48、GH-K3穩定性相近，KP1、KP2最佳MOI分別為0.1、0.01，潛伏期分別為20 min、30 min，爆發期分別約60 min、80 min，較前述報道的噬菌體潛伏期略長，爆發量約分別為15 PFU/cell、11 PFU/cell，約為GH-K3的1/20、1/30。

對肺炎克雷伯菌噬菌體功能研究也有相關報道，Domingo等[21]分析了所分離的4株感染K22莢膜型的肺炎克雷伯菌短尾噬菌體序列，表明其有假定的編碼解聚酶基因；ZCKP1在25 ℃時可使宿主菌K.pneumoniaeKP/01的濃度降低超過2log10CFU/mL，50 PFU/cell的ZCKP1可使宿主菌生物被膜量降低50%[19]；TSK1在感染之初的14 h也可減慢肺炎克雷伯菌繁殖，用TSK1處理后可使培養的肺炎克雷伯菌生物被膜量減少85%～100%，而用TSK1前處理在培養的最初24 h使宿主菌減少比例大于99%[18]；117株噬菌體治療Kp36所致尿路感染模型初始也表現出很強裂解能力[14]；Thiry等[16]以梅隆線蟲幼蟲為模型，發現用噬菌體vB_KpnP_KL106-ULIP47 和vB_KpnP_KL106-ULIP54治療肺炎克雷伯菌ST258株感染，用vB_KpnP_K1-ULIP33治療ST23株感染，可使死亡率從70%降至20%。kpssk3、vB_Kpn_F48無抗生素抗性基因、毒力因子基因及整合酶基因[15，20]。本試驗結果雖為噬菌體用于防控耐藥性肺炎克雷伯菌感染提供了資料，但2株噬菌體是否攜帶抗生素抗性、毒力、整合酶基因及對可裂解菌所致疾病的防治效果均有待深入探究。