小鼠呼吸機誘導(dǎo)的肺損傷相關(guān)基因的生物信息學分析

摘要目的：探討呼吸機誘導(dǎo)的肺損傷VILI的致病機制， 并鑒定相關(guān)標志物，為進一步研究和臨床理論提供基礎(chǔ)。方法：首先從NCBI（美國國立生物技術(shù)信息中心）公共數(shù)據(jù)平臺GEO（Gene Expression Omnibus）下載基因芯片數(shù)據(jù)集GSE9314。然后使用在線分析工具GEO2R對數(shù)據(jù)進行標準化處理并獲得正常肺組織和肺損傷組織之間的差異表達基因（DEGs）。接著用DAVID數(shù)據(jù)庫對篩選出的差異基因進行功能性注釋（GO），通路分析（KEGG）.最后通過STRING數(shù)據(jù)庫和Cytoscape軟件進行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析并識別網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵基因。結(jié)果：初步篩選出583個（p<0.05）差異基因的變化超過一倍，Kegg分析表明，差異基因主要參與TNF信號傳導(dǎo)途徑，以及Toll樣受體信號傳導(dǎo)途徑。而蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析鑒定了十個核心基因，分別為Il6， Ccl3， Tlr2， Cxcl1， Ccl2， Cxcl2， Cxcr2， Itgam， Cd68， 和Il1b。結(jié)論：通過生物信息學分析小鼠肺損傷基因芯片數(shù)據(jù)的差異基因，鑒定的核心基因與相關(guān)通路參與VILI的發(fā)病過程，表明其可能是肺損傷發(fā)病機制的研究新靶點.

關(guān)鍵詞：生物標志物，預(yù)后，呼吸機相關(guān)性肺損傷

呼吸機誘發(fā)的肺損傷（VILI）是與機械通氣相關(guān)的最嚴重且發(fā)病率較高的并發(fā)癥之一[1]。機械通氣下急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）患者VILI的發(fā)生率估計為86%。涉及在插管期間接受機械通氣的外科手術(shù)患者的研究發(fā)現(xiàn)，6.2% 至 24% 的患者發(fā)展為 ALI。因此，研究VILI的分子機制和致病相關(guān)基因?qū)τ谡_管理呼吸系統(tǒng)疾病非常重要。

先前的研究表明，保護性通氣肺中IL-6、IL-8和IL-1β的血漿水平降低，并且該水平與更好的臨床結(jié)果相關(guān)[2]。華萊士 MJ 等。揭示CTGF、CYR61 和 EGR1 可能是早期肺損傷的新標志物[3]。然而，目前預(yù)后工具的效率相對有限，因此需要在 VILI 患者中使用更敏感和特異的分子生物標志物。在這里，我們篩選了VILI 中的十個關(guān)鍵基因（Il6， Ccl3， Tlr2， Cxcl1， Ccl2， Cxcl2， Cxcr2， Itgam， Cd68， 和Il1b）。這些結(jié)果可能為潛在的免疫學機制提供新的見解，并為 VILI 提供潛在的預(yù)后生物標志物。

1數(shù)據(jù)與方法

1.1數(shù)據(jù)

NCBI公共數(shù)據(jù)平臺GEO是最大和最全面的公共基因表達數(shù)據(jù)資源。以“呼吸機性肺損傷”為搜索關(guān)鍵詞，選擇種屬為小鼠，以“陣列表達譜”為檢測類型，得到數(shù)據(jù)集GSE9314。該數(shù)據(jù)集來自弗吉尼亞醫(yī)學院，包含4對VILI和匹配的對照肺組織樣本。

1.2 研究方法

1.2.1差異基因篩選及數(shù)據(jù)處理

為篩選出正常肺組織和 VILI 肺組織的差異基因。本研究使用在線工具GEO2R來進行差異分析。然后將基因表達的差異表示為倍數(shù)變化 （fold change）。| log fold change |> 1，P <0.05作為過濾條件，基于 R語言程序結(jié)合pheatmap包用于差異基因可視化，以及繪制火山圖和熱圖。

1.2.2 GO富集分析和KEGG通路分析

將DEGs數(shù)據(jù)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫，然后我們進行GO分析（基因本體分析），并使用KEGG（京都基因和基因組百科全書）對DEGs進行功能富集。GO富集分析包括三部分，分別為生物過程、細胞組成和分子功能。通路富集根據(jù) P值顯示前10條通路。此外，我們使用 R（版本 3.6.1）為 GO 富集分析和KEGG信號通路分析繪制了條形圖。

1.2.3 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)建設(shè)和模塊分析

我們使用檢索基因相互作用的搜索工具STRING數(shù)據(jù)庫，設(shè)置置信度得分> 0.7的交互被選為對研究具有高置信度.來分析蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）對并構(gòu)建了PPI網(wǎng)絡(luò)。使用Cytoscape軟件對網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)進行可視化分析，然后選擇連通性得分>2的節(jié)點進行進一步分析。

2 結(jié)果

2.1 確定DEG并進行GO分析和KEGG通路分析

GEO數(shù)據(jù)平臺中獲得符合標準的基因芯片數(shù)據(jù)集1個GSE9314.經(jīng)過標準化處理后對其進行DEG分析，篩選出583個基因.

為了進一步了解 DEG 的主要生物學過程（biological process），分子功能（molecular function）以及細胞組成（cellular component），我們進行了GO富集分析。GO分析的細胞組成部分顯示 DEG 位于細胞膜上（圖 2C）并且與炎癥和免疫反應(yīng)有關(guān)（圖 2B）。DEG主要參與趨化因子活性、脂多糖結(jié) 合、生長因子活性-體結(jié)合和肽酶抑制劑活性（圖 2A）。另一方面，KEGG分析顯示調(diào)節(jié)干細胞多能性的通路，如TNF信號通路、Toll樣受體信號通路、補體和凝血級聯(lián)以及NOD樣受體信號通路顯著豐富（圖2D））。

2.2 DEG的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析

為了尋找其他相關(guān)基因網(wǎng)絡(luò)并探索關(guān)鍵信號通路，我們將DEG導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫以獲得PPI網(wǎng)絡(luò)（圖3）。結(jié)果顯示，大部分蛋白間都存在著相互作用，且有多個蛋白位于網(wǎng)絡(luò)中心.按照互作關(guān)系從多到少的原則， 我們將 Il6、Ccl3、Tlr2、Cxcl1、Ccl2、Cxcl2、Cxcr2、Itgam、Cd68 和 Il1b 確定為網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵基因.

3 討論

VILI 是與機械通氣 （MV） 相關(guān)的最常見并發(fā)癥。盡管機械通氣是治療呼吸功能不全的最有效療法，但仍會增加患者的發(fā)病率和死亡率。許多有前途的重要生物介質(zhì)已被確定為基礎(chǔ)科學的顯著成就 （4）。因此，探索與 VILI 相關(guān)的潛在預(yù)后生物標志物非常重要。在這項研究中，與來自微陣列數(shù)據(jù)集GSE9314的正常肺組織相比，在VILI的肺組織中鑒定了583個DEG和十個關(guān)鍵基因。這些DEGs主要富集在啟動炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)的生物過程中，與TNF信號通路、Toll樣受體信號通路等通路密切相關(guān)。表明這些基因可能在 VILI 的免疫機制中具有重要功能。

盡管這十個基因的表達升高影響了VILI患者的免疫機制，但其主要原因和潛在的調(diào)控機制尚不清楚。CXCL1、IL1b、CXCL2細胞與免疫相關(guān)通路的交叉表明，兩條常見的通路是NOD樣受體信號通路和IL-17信號通路。這兩種途徑也與免疫反應(yīng)有關(guān)。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn) CXCL1、IL1b、CXCL2、IL6 的表達上調(diào)，這可能觸發(fā) VILI 中 IL-17 信號的激活。盡管如此，還需要進一步的實驗和研究來驗證樞紐基因并闡明這些基因?qū)?VILI 的調(diào)控機制。

總之，我們的研究確定了在VILI肺組織中觸發(fā)的DEG和關(guān)鍵基因。對基因表達和功能的綜合分析證明了參與 VILI 進展的機制。我們的結(jié)果表明 Il6、Ccl3、Tlr2、Cxcl1、Ccl2、Cxcl2、Cxcr2、Itgam、Cd68 和 Il1b 是預(yù)測 VILI 預(yù)后的潛在生物標志物。需要進一步的研究來闡明中樞基因在 VILI 發(fā)展中執(zhí)行的確切分子機制。

參考文獻

[1]Lionetti V， Recchia FA， Ranieri VM. Overview of ventilator-induced lung injury mechanisms. Curr Opin Crit Care. 2005;13（1）：82–86. doi：10.1097/00075198-200502000-00013.[PubMed] [CrossRef][Google Scholar]

[2]Frank JA， Parsons PE， Matthay MA. Pathogenetic significance of biological markers of ventilator-associated lung injury in experimental and clinical studies. Chest. 2006;130（6）：1906‐1914. doi：10.1378/chest.130.6.1906

[3]Wallace MJ， Probyn ME， Zahra VA， et al. Early biomarkers and potential mediators of ventilation-induced lung injury in very preterm lambs. Respir Res. 2009;10（1）：19. Published 2009 Mar 10. doi：10.1186/1465-9921-10-19

[4]Dos Santos CC， Slutsky AS. The contribution of biophysical lung injury to the development of biotrauma. Annual Review of Physiology 2006; 68：585–618.

作者簡介：龍姣 女 漢族 湖南長沙 （1990年5.） 碩士 住院醫(yī)師 中山大學附屬第七醫(yī)院（廣東深圳）518107 研究方向：肺損傷 寫作方向：肺損傷。