革蘭氏陽性與陰性細菌RNA提取方法的比較與優(yōu)化

云飛 夏婷 石雅麗 雷鵬

摘要：RNA 是除DNA外的存儲遺傳信息的主要載體。隨著分子生物學技術的發(fā)展，提取高純度和完整性的RNA是微生物分子生物學研究的必要前提。RNA提取的本質(zhì)就是破碎細胞壁，釋放細胞內(nèi)部的RNA，利用不同試劑去除多糖、脂類、蛋白以及DNA 等雜質(zhì)，最終獲得高純度、高質(zhì)量的RNA。本實驗選擇總RNA提取試劑盒和改良Trizol法對大腸桿菌（Escherichia coli）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）的RNA進行提取，并對結(jié)果進行分析。

關鍵詞：革蘭氏陽性細菌;革蘭氏陰性細菌;RNA提取;改良Trizol法;

引言

RNA是在蛋白質(zhì)生物合成、生物進化和基因表達中起重要作用的遺傳信息載體。RNA提取是分子生物學研究中的重要試驗，在反轉(zhuǎn)錄、cDNA文庫建立、蛋白質(zhì)體外翻譯中對RNA的要求很高[1]。RNA的提取方式多種多樣，RNA的完整性和純度都會因不同提取方式而有所不同。常用的RNA提取方法有：CTAB（十六烷基三甲基溴）法[2]、熱硼酸法[3]、SDS-Phenol（十二烷基磺酸鈉-苯酚）法[4]，Trizol法[5]等。本實驗以商品化的總RNA提取試劑盒為對照，對Trizol法進行改良，以大腸桿菌（Escherichia coli）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）為實驗材料提取RNA，目的是獲得操作簡單，并且可以大量提取RNA的方法。

1. 常用RNA提取方法

RNA提取的本質(zhì)就是破碎細胞壁，釋放細胞內(nèi)部的RNA，利用不同試劑去除多糖、脂類、蛋白以及DNA 等雜質(zhì)，經(jīng)過一系列的相關操作，最終獲得高純度、高質(zhì)量的RNA的過程。常用的RNA提取方法有：CTAB法、強變性劑法、熱硼酸法、SDS-Phenol法，Trizol法等。

1.1 CTAB法

CTAB與β-巰基乙醇混合后，可使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)發(fā)生改變，從而RNA酶的活性降低。CTAB提取法剛開始被廣泛的應用到提取植物的DNA，之后為提取RNA所用，該方法可除去提取RNA過程中可能影響RNA質(zhì)量的一些物質(zhì)，再進行洗滌沉淀，將RNA沉淀出來，達到提取RNA的目的。這種方法提取RNA的過程簡捷，提取成本不高。

1.2強變性劑法

強變性劑法的特點是在RNA提取液中存在蛋白強變性劑，這種蛋白質(zhì)強變性劑能很好的降低RNA酶對RNA的影響，這種方法可以提取大量的細菌總RNA。異硫氰酸胍、鹽酸胍以及飽和酚等物質(zhì)是蛋白強變性劑且這些物質(zhì)不僅能讓RNA酶的活性降低，也可以成功地使核蛋白和核酸的結(jié)合物分解，在β-巰基乙醇和N-月桂酰肌氨鈉混合之后，其作用可以讓RNA酶的活力降低。

曾有科學家嘗試用變性劑來溶解細菌的細胞膜 [6～7]，成功的從微生物中提取到了mRNA。有研究者通過實驗來比較不同成分的裂解液對RNA提取效果的影響，結(jié)果表明，添加4 mol/LGuscn做變性劑能夠有效的阻礙RNA降解，同時使RNA酶的活性降低，提高所提取的RNA的質(zhì)量[8]。異硫氰酸胍作強變性劑來提取RNA，提取RNA所需的時間長，不適用于大量樣品的提取。

1.3 SDS-Phenol法

SDS能很好地使核蛋白與核酸結(jié)合體分解，還可以與有機溶劑苯酚等物質(zhì)一起混合使用。SDS-phenol法可以在使RNA酶活性降低的同時，使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)發(fā)生改變等。吳麗娟等[4]改良了SDS-Phenol法，這種方法提取細胞總RNA耗時少，速度快。Jahn等人通過熱SDS-phenol法提取到了質(zhì)量較高，純度較高的微生物RNA，提取到的RNA用于基因表達的研究[9]。該方法所提取到的RNA純度較高且完整性好，是一種步驟簡捷、耗時少且高效提取RNA的方法。

1.4 熱硼酸法

硼酸和酚類相結(jié)合構(gòu)成結(jié)合物，這類結(jié)合物可以防止菌體本身所攜帶的酚影響到所要提取的RNA，并且這類結(jié)合物可以和RNA再結(jié)合。在某些特殊離子的作用下，可以使菌體內(nèi)的糖、酚類物質(zhì)分離并使其沉淀，從而達到提取RNA的目的。熱硼酸鹽法提取RNA的時間短，提取過程簡單。

deSaizieu[10]和Selinger[11] 用熱酚法提取RNA，在60℃～ 65℃的溫度下，細胞的溶解速度非常快，而且RNA酶不會影響到RNA的提取。還有一種較為簡便的提取RNA方法，使用溫度適宜的阻斷液，該溶液可以讓RNA不受影響，之后用溶菌酶使細菌裂解，最后用熱酚和氯仿提取RNA。使用比較多的穩(wěn)定總RNA是RNA Later溶液（Ambin and Qiagen）和RNAprotectBacteria Reagent（Qiagen），這種溶液的優(yōu)點是可以快速穩(wěn)定mRNA 群體，使細胞在未提取RNA前，在適當?shù)臈l件下mRNA存活更長時間。

2. 本實驗提取RNA的方法

2.1 供試菌株

大腸桿菌（Escherichia coli）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。大腸桿菌屬于革蘭氏陰性細菌，枯草芽孢桿菌屬于革蘭氏陽性細菌。

2.2試劑與儀器

（1）試劑：Trizol試劑，氯仿，75%的乙醇，無RNA酶水。

（2）器材：移液槍，無核酸酶槍頭，超凈臺，1.5ml無核酸酶離心管，離心機，水浴鍋，微波爐。

2.3試驗方法

2.3.1 Eastp?Super總RNA試劑盒提取微生物RNA

Eastp?Super總RNA試劑盒可以從動植物組織、培養(yǎng)的細胞和細菌內(nèi)提取總RNA，它是通過離心柱膜來快速提取RNA。

（1）操作步驟

取1.5ml菌液（12h，37℃，200rpm培養(yǎng)），提取RNA操作步驟參見試劑盒說明書。提取后，加入30μl無RNA酶水。電泳檢測RNA質(zhì)量，1.5%瓊脂糖凝膠，6μl Marker，2μl RNA，電泳電壓150V，5min，凝膠成像儀拍照。

（2）實驗結(jié)果

利用Eastp?Super總RNA試劑盒提取兩種細菌RNA的凝膠成像圖如下（圖1）。

（3）結(jié)果分析

由圖1可以看出：這種試劑盒提取出來的RNA質(zhì)量高，完整性好，沒有蛋白質(zhì)和基因組DNA的污染。但一次只能處理1-2ml菌液，處理菌液量有限，對于提取大量菌液的RNA不合適。其中圖1中的4號泳道在電泳時沒有加樣1，可能是旁邊泳道的樣品飄樣過來的。

2.3.2 Trizol法提取微生物RNA

Trizol是一種總RNA提取試劑，它是以 “硫氰酸胍-酚-氯仿抽提法”（簡稱“一步法”）為基礎的RNA提取試劑，這種試劑提取RNA的速度快，效率高，提取出沒有污染的RNA質(zhì)量高、產(chǎn)量大。

（1）實驗步驟

1）各取1.5ml的菌液，以轉(zhuǎn)速為10000×g，時長2min離心。去除上層液體，留沉淀。在含有菌體沉淀的離心管中添加200μl溶菌酶溶液（濃度為3mg/ml），靜置1min;

2）往管中加入1ml的Trizol試劑，輕輕彈動，讓沉淀懸浮試劑中，靜置5min。

3）加400μl的氯仿，使之混合，以轉(zhuǎn)速為10000×g，時長5min離心。

4）吸取上層清液500μl置于干凈的離心管內(nèi)，再添加1ml的無水乙醇，于零下20℃的環(huán)境中放置2-3min。

5）放置結(jié)束后，以轉(zhuǎn)速為10000×g，時長10min離心，去除上層清液，干燥2-3min，加入30μl無RNA酶水。

提取后，電泳檢測RNA質(zhì)量，1.5%瓊脂糖凝膠，6μl Marker，2μl RNA，電泳電壓150V，5min，凝膠成像儀拍照。

（2）實驗結(jié)果

Trizol法提取兩種細菌RNA的凝膠成像圖如圖2。

2.3.3 改良Trizol法提取微生物RNA

（1）操作步驟

1）各取1.5ml的菌液，調(diào)節(jié)離心機的轉(zhuǎn)速為10000×g，時長2min進行離心。去除上層液體，留下菌體沉淀。在含有菌體沉淀的離心管里添加200μl溶菌酶溶液（濃度為3mg/ml）

2）在有混合液的離心管中添加1ml的Trizol試劑。

3）向混合液中添加200μl的氯仿，上下輕輕搖晃，使之混合，10000×g，時長10min離心。

4）吸出上層清液500μl放于其他的離心管內(nèi)，再向內(nèi) 添加2倍體積的無水乙醇10000×g，時長5min離心，去除上層清液，再干燥2-3min。加入30μl無RNA酶水。

電泳檢測RNA質(zhì)量，1.5%瓊脂糖凝膠，6μl Marker，2μl RNA，電泳電壓150V，5min，凝膠成像儀拍照。

（2）實驗結(jié)果

改良Trizol法提取兩種細菌RNA的凝膠成像圖如圖2。

（3）結(jié)果分析

實驗結(jié)果如圖2所示，用Trizol法提取到的RNA條帶清晰、整齊、干凈，沒有蛋白質(zhì)和基因組DNA的污染;而用改良Trizol法提取的2種細菌RNA，不僅RNA條帶清晰、整齊、干凈，沒有蛋白質(zhì)和基因組DNA的污染，而且RNA的量較大。

3 展望

本實驗所用的大腸桿菌Escherichia coli和枯草芽孢桿菌Staphylococcus aureus分別屬于革蘭氏陰性細菌和革蘭氏陽性細菌，前者細胞壁肽聚糖較薄，易于破壁，后者細胞壁肽聚糖較厚，不易破壁。總RNA試劑盒也能很快提取到RNA，提取時間為1h左右，而且試劑盒內(nèi)提供的試劑中有能使RNA酶活性降低的物質(zhì)，可以減少RNA降解。用這種方法提取的RNA的質(zhì)量好、有較好的完整，純度也高。但是產(chǎn)物量少，大量提取時成本較高。用Trizol法能提取出的細菌RNA，RNA質(zhì)量較好，純度較高，但是產(chǎn)物量少。改良Trizol法可以很快速提取出細菌RNA，不僅質(zhì)量好、純度高、產(chǎn)量高，而且可以大量獲得細菌RNA，所以本實驗摸索的改良Trizol法達到了預期效果。

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作者簡介：云飛（1981年9月-），男，蒙古族，內(nèi)蒙古土左旗人，博士，講師，研究方向為基因工程。

通訊作者：石雅麗，（1981年10月-），女，漢族，內(nèi)蒙古正藍旗人，博士，講師，碩士生導師，研究方向為基因工程。

基金項目：此文由2020年內(nèi)蒙古自治區(qū)自然科學基金面上項目，項目名稱：來源于蒙古牛瘤胃的堅硬芽孢桿菌降解纖維素機理的研究，項目負責人：石雅麗，項目編號：No. 2020MS03030

由2015年內(nèi)蒙古工業(yè)大學科學研究項目，項目名稱：海拉爾賦煤區(qū)煤系共生鍺賦存規(guī)律，項目負責人：云飛，項目編號：No. ZD201524

由2017年內(nèi)蒙古工業(yè)大學科學研究項目，項目名稱：基于瘤胃微生物組學中纖維素酶的研究，項目負責人：石雅麗，項目編號：No. ZD201703 。