UPLC-MS/MS測定健脾丸中的黃曲霉毒素G2、G1、B2和B1

劉東升 劉志榮 姚世霞 楊平榮 朱旭江*

(1.甘肅省藥品檢驗研究院，蘭州 730030，2. 國家藥品監(jiān)督管理局中藥材及飲片質(zhì)量控制重點實驗室，蘭州 730030)

黃曲霉毒素作為一類分子結(jié)構(gòu)相似的次級代謝產(chǎn)物，由黃曲霉和寄生曲霉在繁殖過程中產(chǎn)生。其中黃曲霉毒素B1作為毒性和致癌性最強的17種中的一種黃曲霉毒素，毒性僅次于肉毒霉素，而且早在1993年，黃曲霉毒素被世界衛(wèi)生組織(WHO)的有關(guān)研究機構(gòu)確定為I類致癌物[1-3]。2020版《中國藥典》收載了九香蟲、土鱉蟲、延胡索等22種中藥材中黃曲霉毒素檢查項，規(guī)定黃曲霉毒素G2、G1、B2和B1總量不得超過10μg/kg，黃曲霉毒素B1不得超過5μg/kg。未對中成藥中可的黃曲霉毒素加以限度規(guī)定，但原粉入藥的中成藥尤其處方中存在含易被黃曲霉毒素污染的藥材或飲片時，黃曲霉毒素污染的問題值得更加關(guān)注。健脾丸中處方中的陳皮、枳實、山楂、麥芽均為來源于植物的種子或種皮，在制備、儲藏和運輸?shù)倪^程中存在易發(fā)生霉變和污染黃曲霉毒素且處方中的黨參和麥芽粉為部分原粉入藥。進一步研究發(fā)現(xiàn)目前對中藥材中的黃曲霉毒素測定大多數(shù)選用衍生化-高效液相色譜法[4-8]，但是黃曲霉素檢測為痕量檢測，且中成藥的基質(zhì)效應(yīng)影響，部分中成藥及中藥材在檢測過程中易出現(xiàn)假陽性結(jié)果。據(jù)此建立超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對健脾丸(大蜜丸和小蜜丸)中的黃曲霉毒素G2、G1、B2和B1進行測定。

1 儀器與試藥

TQ5500三重四級桿液質(zhì)聯(lián)用儀；AE-204電子分析天平；DFY-200C粉碎機；HGC-24A氮氣吹干儀；SK-1渦旋攪勻器；5430R低溫離心機；免疫親和柱(批號：1067)。

黃曲霉毒素G2、G1、B2和B1混標(批號：610001-201602，G2、G1、B2和B1濃度分別為0.38 μg/mL、1.06 μg/mL、0.43 μg/mL和1.02 μg/mL)；甲醇、醋酸銨(色譜純)；吐溫20、氯化鈉(分析純)；水為超純水。

樣品：2018年國抽樣品，12家生產(chǎn)企業(yè)，27批次健脾丸樣品(其中大蜜丸26批和1批小蜜丸)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：CAPCELL CORE C18 (4.6 mm×150 mm，2.7 μm)；以10 mmol/L醋酸銨溶液為流動相A，甲醇為流動相B，梯度洗脫程序：0～12 min，55% A-35% A；12～15 min，35% A-10% A；15～15.5 min，10% A-45% A；15.5～20 min，45% A；柱溫30℃；進樣量：5 μL；流速每分鐘0.3 mL。

2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源，正離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測模式；離子源溫度550℃；霧化氣(Gas 1)45；霧化輔助加熱氣(Gas 2)45；毛細管電壓5500 V；掃描時間100 ms；黃曲霉毒素G2、G1、B2和B1對照品的檢測離子對、碰撞電壓和保留時間等質(zhì)譜參數(shù)，見表1。

表1 質(zhì)譜分析參數(shù)

2.3 溶液的制備

2.3.1對照品儲備溶液的制備

精密量取黃曲霉毒素混合溶液1 mL于25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，作為黃曲霉毒素G2、G1、B2和B1的對照品儲備液(黃曲霉毒素G2、G1、B2和B1濃度分別為15.2 ng/mL、42.4 ng/mL、17.2 ng/mL、40.8 ng/mL)。

2.3.2供試品溶液的制備

取研細后的樣品約5.0 g加入含有氯化鈉1 g和70%甲醇溶液25.0 mL的三角瓶中，高速離心(大于11000轉(zhuǎn)/分鐘)處理2分鐘后，再離心(3000轉(zhuǎn)/分鐘)5分鐘，取出，靜置2分鐘，取上清液5.0 mL，加入50 mL的容量瓶中，最后用1%吐溫20稀釋至刻度線，搖勻，濾過(玻璃纖維濾紙)，取續(xù)濾液20 mL，通過免疫親合柱，控制流速(3 mL/min)，分別按次序用1%吐溫20和水各10 mL進行充分洗脫，棄去洗脫液，并排干柱子中的水分，再用約1.5 mL甲醇洗脫，收集洗脫液，置2 mL量瓶中，并用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3.3陰性樣品溶液制備

取健脾丸陰性樣品(按處方及工藝，制備不含黃曲霉毒素G2、G1、B2和B1的健脾丸陰性樣品)5.0 g，按供試品溶液的制備方法制備。

2.4 方法學(xué)驗證

2.4.1專屬性考察

取“2.4.2”項下黃曲霉毒素G2、G1、B2和B1對照品溶液(質(zhì)量濃度分別為1.52 ng/mL、4.24 ng/mL、1.72 ng/mL、4.08 ng/mL)、供試品溶液及陰性樣品溶液，按“2.1”和“2.2”項下色譜條件測定，見圖1。結(jié)果表明陰性樣品溶液色譜圖中在與黃曲霉毒素G2、G1、B2和B1相應(yīng)的保留時間無色譜峰，說明其他藥材及溶劑對黃曲霉毒素G2、G1、B2和B1的測定無干擾，以本法測定健脾丸中黃曲霉毒素G2、G1、B2和B1的含量具有專屬性。

圖1 超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用圖a.對照溶液；b.陽性樣品；c.陰性樣品；1.黃曲霉毒素G2；2.黃曲霉毒素G1；3.黃曲霉毒素B2；4.-黃曲霉毒素B1

2.4.2工作曲線與線性范圍

取上述“2.3.1”項下黃曲霉毒素G2、G1、B2和B1對照品儲備液，分別制得黃曲霉毒素G2、G1、B2和B1的系列對照濃度，按“2.1”和“2.2”項下條件，測定相應(yīng)峰面積。其中以峰面積值為縱坐標(Y)，質(zhì)量濃度(ng/mL)為橫坐標(X)繪制曲線，并進行回歸分析。結(jié)果見表2。

表2 線性關(guān)系考察結(jié)果

2.4.3精密度試驗

精密吸取“2.4.2”項下質(zhì)量濃度分別為1.52 ng/mL、4.24 ng/mL、1.72 ng/mL、4.08 ng/mL的黃曲霉毒素G2、G1、B2和B1對照品溶液5 μL，連續(xù)進樣6次，測定峰面積，結(jié)果黃曲霉毒素G2、G1、B2和B1峰面積積分值的RSD值分別為1.35%、0.58%、0.95%、2.16%，表明儀器精密度良好。

2.4.4重復(fù)性試驗

取同一批號的健脾丸樣品共6份各約5 g，精密加入黃曲霉毒素G2、G1、B2和B1對照品溶液(質(zhì)量濃度分別為1.52 ng/mL、4.24 ng/mL、1.72 ng/mL、4.08 ng/mL)各1.0 mL，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，每份進樣2針，記錄峰面積，結(jié)果顯示黃曲霉毒素G2、G1、B2和B1峰面積積分值的RSD值分別為1.88%、1.23%、2.06%、1.55%，表明該分析方法重復(fù)性良好。

2.4.5回收率試驗

精密量取“2.4.2”項下黃曲霉毒素對照品溶液(黃曲霉毒素G2、G1、B2和B1質(zhì)量濃度分別為1.52 ng/mL、4.24 ng/mL、1.72 ng/mL、4.08 ng/mL)1 mL，分別加入6個三角瓶中，用氮氣吹干，精密稱取研細后的健脾丸樣品(H廠，批號：A17019，完全不含黃曲霉毒素G2、G1、B2和B1樣品)約5 g，分別于以上6個三角瓶中按供試品溶液的制備方法處理，按上述色譜條件下測定。結(jié)果黃曲霉毒素G2、G1、B2和B1回收率分別為在86.8%、88.0%、86.6%、91.7%，RSD(n=6)分別為2.1%、2.6%、2.7%、1.9%。

2.4.6穩(wěn)定性試驗

取同一批號的樣品約5 g，精密加入黃曲霉毒素G2、G1、B2和B1對照品溶液(質(zhì)量濃度分別為1.52 ng/mL、4.24 ng/mL、1.72 ng/mL、4.08 ng/mL)1.0 mL，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，分別在0、4、16、24、30、36小時進樣，測定供試品溶液中黃曲霉毒素G2、G1、B2和B1的峰面積，計算峰面積RSD。實驗結(jié)果顯示36小時內(nèi)黃曲霉毒素G2、G1、B2和B1峰面積積分值的RSD(n=6)分別為1.97%、2.09%、2.43%、1.65%，說明供試品溶液在36小時內(nèi)穩(wěn)定可測。

2.4.7檢出限和定量限考察

取“2.4.2工作曲線與線性范圍”項下不同濃度的黃曲霉毒素G2、G1、B2和B1混合對照品溶液，精密吸取5 μl，進樣并記錄色譜圖，計算當信噪比為3∶1時的濃度為儀器檢出限。計算當信噪比為10∶1時的濃度為儀器定量限。黃曲霉毒素G2、G1、B2和B1檢出限分別0.030 ng/mL、0.085 ng/mL、0.034 ng/mL和0.082 ng/mL。由于實驗過程中均未檢出除黃曲霉毒素B1外的其他成分，所以只計算了黃曲霉毒素B1的定量限為0.16 ng/mL。同時實驗也考察了方法的檢出限，測得陰性基質(zhì)中4種黃曲霉毒素的方法檢出限分別為0.1 μg/kg、0.2 μg/kg、0.1 μg/kg、0.2 μg/kg，均低于《中國藥典》2020年版中對黃曲霉毒素的檢出限(0.3 μg/kg)，滿足樣品測定需求。

2.5 樣品測定

取“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”和“2.2”項下條件進行測定，結(jié)果見表3。

表3 含量測定結(jié)果

3 討論

3.1 提取和凈化條件的優(yōu)化

《中國藥典》2020年版四部“2351 真菌毒素測定法”―是否應(yīng)為第一法、黃曲霉毒素測定法(第二法)為通用方法，可適用于中藥材及其制劑中黃曲霉毒素總量以及B1的限量考察。但是在實驗中發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)在方法學(xué)驗證中黃曲霉毒素G2和G1的回收率偏低，所以實驗參照《中國藥典》2020年版 四部和文獻報道的方法基礎(chǔ)上，結(jié)合樣品特點(易溶于甲醇、乙醇和乙腈等有機溶劑)最終選用70%甲醇作為提取溶劑，黃曲霉毒素的提取率更高，同時色譜圖中雜質(zhì)峰較少；由于樣品取樣量較大使得溶液比較渾濁，為了減少實驗過程中黃曲霉毒素的損失取高速離心下的上清液。利用免疫親和柱對黃曲霉毒素的專屬吸附性和1%吐溫-20進行洗脫，有效消除樣品中基質(zhì)影響，達到對樣品進行凈化處理的目的。為了進一步提高黃曲霉毒素的溶出率在供試品溶液的制備過程中加入適量的氯化鈉。

3.2 色譜條件優(yōu)化

參照文獻報道[9-11]分別考察了甲醇/乙腈-0.1%甲酸、甲醇/乙腈-10 mmol/L醋酸銨、甲醇/乙腈-10 mmol/L甲酸銨在等度和梯度條件下的色譜分離效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在醋酸銨存在的流動相體系中，黃曲霉毒素各成分在色譜系統(tǒng)中均能達到很好的色譜分離效果和離子化效果。試驗中還進行了其他耐用性研究①不同色譜柱考察，選擇不同品牌色譜柱CAPCELL CORE、MG和HITACHI分別試驗，結(jié)果表明不同色譜柱對分離度影響較小；②不同柱溫考察：分別考察在28℃、30℃和32℃柱溫下對分離度的影響，結(jié)果表明該法能適應(yīng)柱溫微小的變動，方法耐用性良好；③不同流速考察：分別考察流速為0.28 mL/min、0.3 mL/min和0.32 mL/min時對分離度的影響，結(jié)果表明該法能適應(yīng)流速微小的變動，方法耐用性較好。

3.3 質(zhì)譜條件優(yōu)化

采用甲醇-10 mmol/L醋酸銨為流動相，分別在正離子和負例子模式下對黃曲霉毒素G2、G1、B2和B1進行全掃描，發(fā)現(xiàn)在正離子模式下黃曲霉毒素G2、G1、B2和B1的響應(yīng)值均高于負離子模式下的響應(yīng)值即選用正離子模式；并對毛細管電壓、碰撞電壓及質(zhì)譜分辨率等條件進行優(yōu)化。在上述條件下，分別以正電離模式下得到各自的準分子離子[M+H]+為母離子，再對各母離子產(chǎn)生的子離子及子離子的碰撞能量等其他參數(shù)進行優(yōu)化選擇，選取響應(yīng)最高且干擾較小的子離子作為定量離子，次之的作為定性離子，最終確定的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

按上述色譜條件，分別對上述12家生產(chǎn)企業(yè)27批次健脾丸樣品進行黃曲霉毒素的測定。結(jié)果27批次健脾丸樣品中，12批健脾丸樣品(8個廠家)檢出黃曲霉毒素B1，總檢出率達到44.4%，部分生產(chǎn)企業(yè)檢出率達到100%，但均低于定量限。綜上所述，該方法能夠有效排除假陽性樣品干擾且操作簡便，靈敏度高，專屬性強，可用于健脾丸(大蜜丸和小蜜丸)中黃曲霉毒素G2、G1、B2和B1的測定并，對提高中藥的安全性有很大的意義。