元素分析-同位素質譜測定蜂蜜中碳-4植物糖含量的能力驗證結果與分析

謝金彤 張普霞 季美泉* 王栩璐 丁 濤 費曉慶 王 艷 林 宏 鄧曉軍 伊雄海 韓 芳 謝 文 蔣沁婷

(1. 南京海關動植食中心, 南京 210019; 2. 上海海關動植物與食品檢驗檢疫技術中心, 上海 200002;3. 合肥海關技術中心, 合肥 230000; 4. 杭州海關技術中心，杭州 310000)

1 引 言

蜂蜜是蜜蜂采集花蜜釀造而成的。天然純正的蜂蜜具有優越的口感、獨特的抗菌活性、具有較高的保健價值。隨著被更多人的喜愛與追捧，與其他高附加值的產品一樣，蜂蜜摻假現象也隨之增加。我國是蜂蜜生產大國、消費大國和進出口大國，蜂蜜摻假情況日益嚴重，蜂蜜的品質和安全關乎民生。目前蜂蜜摻假鑒別方法主要薄層色譜法、碳-4植物糖含量測定法、液相色譜及其聯用技術、氣相色譜及其聯用技術、光譜法、核磁共振等[1-6]。而碳-4植物糖含量測定法是蜂蜜產品檢測中重要指標，對于蜂蜜的收購價格和銷售價格都有重要的影響。碳-4植物糖含量以蜂蜜中蛋白質δ13C值為基準，蜂蜜δ13C值與其進行比較，根據GB/T 18932.1-2002《 蜂蜜中碳-4植物糖含量測定方法 穩定碳同位素比率法》蜂蜜中碳-4植物糖含量的計算公式，得到蜂蜜中碳-4植物糖的含量[7]；當計算結果含量大于7%時，被標準認定該蜂蜜中摻有碳-4植物糖。

測定蜂蜜中碳-4植物糖含量使用的儀器為元素分析-穩定同位素質譜儀，近年來該儀器在國內檢測機構、科研機構中逐漸普及，絕大多數政府實驗室、第三方檢測機構，部分蜂蜜企業都擁有該儀器設備，具備開展相關檢測工作的能力。為保證政府實驗室，第三方檢測實驗室及企業蜂蜜質量自控結果的準確性和一致性，有必要在該領域開展能力驗證項目。

能力驗證是分析判斷實驗室綜合檢測能力的有效方式之一, 是通過實驗室間比對評價實驗室的檢測校準/試驗檢測能力或檢驗機構的綜合檢測能力[8,9]。能力驗證計劃為實驗室提供了一個通過評估和分析證明其檢測數據可靠性的客觀實驗途徑。本研究設計組織蜂蜜中碳-4植物糖含量測定能力驗證項目, 評價了來自 11個地區的 19家實驗室的檢測能力和測定結果, 了解國內實驗室在蜂蜜中碳-4植物糖含量檢測的整體水平，實驗室間存在的差異的得到了基本的了解與掌握, 相關實驗室檢測能力得到了驗證和強化，促使實驗室保持和提高在同位素比值質譜法檢測蜂蜜中碳-4植物糖含量方面的能力, 保障了蜂蜜的質量安全, 也為政府食品質量監管部門提供了技術參考。

2 材料與方法

2.1 樣品制備

本次能力驗證蜂蜜樣品從國內某蜂蜜企業購買，3種不同同位素數值的蜂蜜，到實驗室后利用攪拌機再次混勻。樣品使用塑料瓶包裝，每份樣品均在90g左右，常溫保存。樣品采用3份設計，其中考核樣1份為H，考核樣品H之間水平無差異，干擾樣2份為B1、B2。每個實驗室將相應地獲得2份樣品，包括1個考核樣品H和1個隨機的干擾樣品B。 在樣品分裝寄送時，隨機抽取，為保證樣品不出現交叉污染，分別在每個塑料瓶瓶口套上封口膜再套上塑料自封袋；為保證樣品在寄送過程中不出現擠壓導致破碎，在寄送紙盒內放入泡沫塑料進行減壓防震。

2.2 檢測方法

GB/T 18932.1-2002《蜂蜜中碳-4植物糖含量測定-穩定碳同位素比率法》為本次能力驗證水平測試的檢測方法中的推薦方法。需要檢測兩項指標：蜂蜜的碳同位素比值δ13Ch和蜂蜜中蛋白質的碳同位素比值δ13CP，根據這兩項參數計算蜂蜜碳-4植物糖含量。

2.3 儀器與試劑

本實驗室采用的設備和試劑：

純水儀 ，提供超純水用來洗滌蜂蜜中蛋白質、溶解蜂蜜。

臺式高速離心機 XIR，用于蜂蜜樣品中的蛋白質的離心。

穩定同位素質譜儀聯用儀EA-IRMS，用于測定蜂蜜δ13Ch值、蜂蜜中蛋白質的δ13Cp值。

標準物質：IA-R00513C Beet Sugar(δ13C值為-26.03‰)。

錫杯5×3.5 mm；鎢酸鈉、硫酸(分析純)。

蜂蜜沉淀蛋白的沉淀劑：0.335 mol/L稀硫酸溶液和10﹪鎢酸鈉水溶液。

各實驗室可根據自身條件調整，各實驗室采用的前處理方式、設備和標準物質相關信息均需在結果報告單中詳細說明。

2.4 統計方法與結果評價

本次能力驗證計劃中統計方案設計與評價方法按照《能力驗證結果的統計處理和能力評價指南》GB/T 28043-2011和CNAS-GL002：2018中相關要求規范進行[10]。采用穩健(Robust)中位統計技術處理作為結果統計與分析的方法，以減少極端值(即離群值)對統計結果的影響。

其中，med為中位值,‰;NIQR為標準化四分位距;Z比分數的大小代表實驗室的結果，X與指定值或中位值med的偏離程度，而符號“+”和“-”代表指定值或中位值med的偏離方向。

本次能力驗證計劃項目以計算的Z比分數來評價每個參加能力驗證計劃實驗室的檢測能力，即：

︱Z︱≤2為滿意結果；

2<︱Z︱<3為存有問題的結果(可疑值)；

︱Z︱≥3為不滿意結果(離群值)。

3 結果與分析

3.1 參加的實驗室情況

全國共有19家實驗室報名參加本次能力驗證，包括15家政府實驗室、3家第三方檢測實驗室和1家企業實驗室覆蓋了11個省份。參加此次能力驗證計劃的實驗室的地域分布和數目見圖1。19家實驗室均報告結果。

圖1 參加實驗室地域分布情況

3.2 均勻性測定結果

考核樣品發給實驗室前，按照《能力驗證樣品均勻性和穩定性評價指南》CNAS-GL003:2018的要求，采用單因子方差分析法，通過F檢驗對樣品進行均勻性檢驗，F值小于自由度為(f1，f2)及給定顯著性水平α(通常α=0.05)的臨界值Fα(f1，f2)時，認為樣品是充分均勻的。本次能力驗證考核樣品H的均勻性檢驗結果見表1，考核的樣品H的F值

表1 樣品中δ13Ch和δ13CP均勻性測試分析結果

參加實驗室檢測數據回收之后，用均勻性測試結果的考核樣品間標準差Ss除以參加實驗室檢測數據匯總統計得出的標準偏差σ，以比值小于0.3為原則,Ss< 0.3σ確定考核樣品是均勻。本次能力驗證的Ss< 0.3σ，表明考核的樣品H間無顯著性差異，考核樣品是均勻的,結果見表2。

表2 樣品中δ13Ch和δ13CP均勻性測試驗證結果

3.3 穩定性測試結果

使用標準CNAS-GL003:2018《能力驗證樣品均勻性和穩定性評價指南》，對考核樣品進行極限溫度和儲存條件兩種類型的穩定性試驗。

首先是考察環境對樣品穩定性的影響，模擬樣品的極限溫度運輸條件下的穩定性試驗，針對不同溫度點不同的保存時間測試。分別把樣品存放在-18℃冰箱、4℃冰箱和37℃培養箱，樣品的穩定性采用t檢驗法評價，具體情況見表3。當自由度為10，對應的t臨界值t0.05(10)=2.23，計算得到的t值< t臨界值t0.05(10)，這表明在0.05顯著性水平時，樣品中的結果之間無顯著性差異，樣品的δ13Ch和δ13CP結果是穩定的。

表3 環境對于樣品中δ13Ch和δ13CP穩定性測試分析結果

另外，對考核樣品在貯存溫度下的穩定性試驗，以便于確認考核樣品δ13Ch值和δ13CP值在能力驗證計劃執行周期內是否穩定，分別在第1天、第2天、第3天、第13天、第24天、第37天、第51天、第65天、第96天一共進行9次能力驗證穩定性試驗，采用t檢驗法對其穩定性進行評價，本次能力驗證樣品H的穩定性檢驗結果見表4 。當自由度為10，對應的t臨界值t0.05(10)=2.23，計算得到的t值< t臨界值t0.05(10)，這表明96天內在0.05顯著性水平時，樣品中的結果之間無顯著性差異，樣品的δ13Ch和δ13CP結果是穩定的。

表4 樣品中δ13Ch和δ13CP值穩定性測試分析結果

3.4 總體能力驗證統計結果

本次能力驗證參加實驗室相應地獲得了兩份樣品，包括1個考核樣品H和一個隨機的干擾樣品B(B包含B1、B2兩個不同同位素數值樣品)，考核樣品H之間水平無差異。補測時，干擾樣替換成另一個樣。干擾樣不能被計入最后的結果統計和檢測能力評價中。共有19家重點實驗室報名參與本次能力驗證。本次能力驗證計劃共發出樣品19組，共有19家實驗室報告了有效結果，通過對報告結果進行的統計分析，包括即結果總數(N)、中位值(med)、標準化四分位距(NIQR)、穩健變異系數(Robust CV)、極小值(Min)、極大值(Max)等，詳情見表5。

表5 主要穩健參數統計結果(樣品H)

3.5 結果評價

采用柱狀圖表示有關的統計量，更加直觀地了解本次能力驗證活動參加實驗室的情況，的結詳見圖2和圖3。實驗室的唯一識別代碼標注在對應的柱形圖旁，柱形圖是按其Z值的大小順序排列的。

圖2 H樣品δ13Ch的Z比分數柱狀圖

圖3 H樣品δ13Cp的Z比分數柱狀圖

本次能力驗證初測結果的19家實驗室中，結果滿意的實驗室共15家，占實驗室總數的 78.9%；結果可疑的共3家，占實驗室總數的15.8 %；結果離群的有1家，占實驗室總數的5.3%。檢測結果的總體情況見表6 。

表6 各實驗室能力驗證結果

說明參加本次能力驗證的絕大多數實驗室可以準確的檢測蜂蜜中碳-4植物糖含量，具有較高的檢測水平。考核中結果可疑或離群的，主要是由于未按檢測標準的要求進行樣品前處理、儀器設備未能調試至最佳狀態、標準物質使用不恰當等原因引起的。

3.6 技術分析與建議

3.6.1標準物質的影響

在碳同位素檢測過程中，標準物質的正確使用對于檢測準確性是至關重要的。本次能力驗證參加的實驗室中6家使用咖啡因IAEA-600，數值：-27.771±0.043‰；2家使用甜菜糖 IA-R005，數值：(‰)26.03±0.11‰；5家使用橄欖油 CatNoB2172 ，數值：(‰)29.32±0.15‰；1家使用RM8542 ，數值：(‰)10.45±0.07‰；1家使用IVA33802174 ，數值：-37.32±0.04‰。其余幾家標準物質數值均在-28.06‰至-26.39‰之間。由于檢測時需要標準物質進行定值，所以選擇與考核樣碳同位素比值相接近的標準物質就顯得尤為重要。考核樣的碳同位素數值δ13Ch和δ13CP分別為-23.81‰和-24.72‰，其中兩家實驗室所用標準物質碳同位素數值為-10.45±0.07‰和-37.32±0.04‰與考核樣的碳同位素數值相差較大，實際使用的實驗室所報考核樣結果也為可疑結果。建議實驗室應確保所用標準物質的碳同位素數值與所檢測樣品碳同位素數值相接近。

3.6.2對作業指導書的理解

本次能力驗證中大多數實驗室能夠正確的理解作業指導書，也有少部分做的不到位的現象，比如結果有效數字位數、樣品標識的填寫等方面。建議實驗室加強對于作業指導書內容的解讀及能力驗證相關人員的培訓。

3.6.3儀器設備的影響

本次能力驗證參加實驗室中，5家使用的設備沒有使用參考氣，14家使用的設備有參考，而使用了參考氣的實驗室結果滿意率為92.8%，未使用參考氣的實驗室結果滿意率為40% 。由于同位素檢測過程存在偶發性，使用穩定的參考氣作為定值的參照尤為重要。

3.6.4檢測過程的質量控制及對標準的理解

參加本次計劃的實驗室均聲稱嚴格按照《蜂蜜中碳-4植物糖含量測定-穩定碳同位素比率法》GB/T 18932.1-2002的檢測方法進行檢測。該方法需要對樣品進行兩步處理，第一部分用于測定蜂蜜的碳同位素比值δ13Ch，第二部分用于提取蛋白質測定蜂蜜蛋白質的碳同位素比值δ13CP。蜂蜜稱取前需要搖勻，防止結晶影響檢測結果。當蜂蜜中花粉含量過高時，需要除去花粉，減少其對δ13Ch測定的影響。很多時候δ13Ch測不準就是這個原因導致。在蛋白提取后，如果蛋白質中的糖未能用水洗滌充分將會導致δ13CP結果偏向δ13Ch；進樣時所取的蛋白測試樣不均勻，可能會取到更多的花粉，使得δ13CP結果遠離δ13Ch一方，可能造成假陽性。所以要理解標準文本中每一個實驗步驟的目的，省察每個步驟的完成情況，來確保樣品在進入設備分析前是均勻且可信的。

4 結 論

在本次能力驗證參加的實驗室有近一半都是沒有或較少有蜂蜜中碳-4植物糖含量檢測經驗的。絕大部分實驗室結果都是滿意的，少數實驗室出現不滿意或有問題結果的情況需要后期對照糾正。希望通過此次能力驗證，增強實驗室間溝通，提高全國不同系統的實驗室利用同位素比值方法對蜂蜜中碳-4植物糖含量檢測的整體水平。