大黃素納米結構脂質載體在大鼠體內的藥動學及組織分布

馬 開， 辛玉鳳， 田 萍， 位恒超， 祝俠麗， 劉雅敏， 韓德恩,3*

(1.河南省中醫藥研究院，河南 鄭州 450004；2.河南中醫藥大學藥學院，河南 鄭州 450046；3.河南省中藥特色炮制技術工程研究中心，河南 鄭州 450046)

大黃素是一種游離型蒽醌化合物，為大黃主要化學成分之一[1]，具有抗炎[2-3]、鎮痛[4]、抗菌[5]、抗腫瘤[6]、保護器官[7]等多種藥理作用，但該成分具有水溶性差、半衰期短、生物利用度低等缺點[8]，從而限制了其臨床應用。納米結構脂質載體是在固體脂質納米粒的基礎上，以固體和液體混合脂質為載體制備的新型納米載藥系統，它克服了后者載藥量低、貯存過程中藥物易泄漏等缺陷[9]，不僅具有生物兼容性良好、藥物生物利用度高等優點，還有著緩釋靶向作用[10]，同時藥物藥動學和組織分布也會發生顯著變化[11-13]，開發前景良好。

課題組前期已對大黃素納米結構脂質載體制備工藝進行優化[14]，本實驗在此基礎上灌胃給予大鼠該制劑，采用超高效液相色譜-四級桿/靜電場軌道阱高分辨質譜(UPLC-Q-Orbitrap HRMS)法測定不同時間點大鼠血漿及各組織中該成分血藥濃度，考察其體內藥動學及組織分布，以期為相關制劑后續開發及臨床應用提供依據。

1 材料

超高效液相色譜-四級桿軌道肼高分辨質譜儀(UPLC-Q-Orbitrap HRMS，美國賽默飛世爾科技公司)；MS105DU電子分析天平(十萬分之一，瑞士梅特勒-托利多公司)；UPD-Ⅱ-107優普超純水機(成都超純科技有限公司)；VORTEX3旋渦混勻器(德國IKA公司)；JW-3021HR高速冷凍離心機(安徽嘉文儀器裝備有限公司)；EFAA-DC24-RT氮吹儀(上海安譜科學儀器有限公司)。

大黃素、甲基異茜草素(批號分別為wkq16071004、wkq18012405，純度>98%，四川省維克奇生物科技有限公司)；肉豆蔻酸異丙酯(批號N18100621)、單硬脂酸甘油酯(批號N18051206)、大豆卵磷脂(批號N18061105)、泊洛沙姆188(批號N18110725)均購自南京都萊生物技術有限公司。甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純[賽默飛世爾科技(中國)有限公司]。

SPF級SD大鼠，雄性，體質量(235±20)g，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，動物生產許可證號SCXK(魯)20190003，標準環境下飼養1周。動物實驗方案獲得河南中醫藥大學實驗動物倫理委員會批準。

2 方法與結果

2.1 大黃素納米結構脂質載體制備 參考文獻[14]報道，精密稱取3.27 mg大黃素、200.00 mg單硬脂酸甘油酯、148.68 mg肉豆蔻酸異丙酯，加入少量無水乙醇助溶，65 ℃下加熱熔融，揮干乙醇，作為油相；精密稱取100.00 mg大豆卵磷脂、173.48 mg泊洛沙姆188，水浴加熱至60 ℃，作為水相，磁力攪拌(1 000 r/min)下將水相趁熱滴加到乙醇揮盡的油相中，制成O/W型初乳，迅速用探頭超聲30 min(每工作2 s停止2 s)，冰水浴冷卻固化，定容至20 mL，過0.22 μm微孔濾膜，即得。

2.2 對照品、內標溶液制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取大黃素對照品5.20 mg，置于100 mL量瓶中，甲醇超聲溶解并定容至刻度，精密量取1 mL，置于10 mL量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成5.2 μg/mL貯備液，甲醇稀釋至1.04、2.08、5.20、10.40、20.80、52.00、104.00、520.00、1040.00 ng/mL，即得。

2.2.2 內標溶液 精密稱取甲基異茜草素對照品4.67 mg，置于100 mL量瓶中，甲醇超聲溶解并定容至刻度，制成46.7 μg/mL貯備液，精密量取0.5 mL，置于100 mL量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得(質量濃度為0.233 μg/mL)，4 ℃下冷藏備用。

2.3 分析條件

2.3.1 色譜 Waters ACQUITY UPLC?HSS T3色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；流動相0.1%甲酸-乙腈(15∶85)；體積流量0.3 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量5 μL。

2.3.2 質譜 電噴霧離子源(ESI)，選擇性離子監測模式(SIM)；噴霧電壓3.0 kV；離子傳輸管溫度350 ℃；加熱器溫度300 ℃；鞘氣體積流量35 arb，輔助氣體積流量10 arb；碰撞能量45 V；定量離子(大黃素)m/z269.045 1；內標(甲基異茜草素)m/z253.049 8。

2.4 生物樣本前處理 精密吸取50 μL血漿，置于1.5 mL離心管中，加入50 μL 0.233 μg/mL內標(甲基異茜草素)溶液，渦旋混合30 s，再加入400 μL蛋白沉淀劑(甲醇)，渦旋混合3 min，12 000 r/min 離心5 min，取300 μL上清液，氮氣吹干，殘渣加100 μL甲醇復溶，12 000 r/min離心5 min，取上清液。

取組織樣品1 g，加入3 mL 0.9% NaCl溶液進行勻漿，精密吸取勻漿液50 μL，置于1.5 mL離心管中，加入50 μL 0.233 μg/mL內標溶液，渦旋混合30 s，再加入400 μL蛋白沉淀劑(甲醇)，渦旋混合3 min，12 000 r/min 離心5 min，取300 μL上清液，氮氣吹干，殘渣加100 μL甲醇復溶，12 000 r/min離心5 min，取上清液，待測。

2.5 方法學考察

2.5.1 專屬性試驗 取空白血漿/組織勻漿樣品、含藥血漿/組織勻漿樣品(2.6 ng/mL大黃素)、給藥1 h后血漿/組織勻漿樣品加內標(甲基異茜草素)溶液，在“2.3”項條件下測定，結果見圖1。由此可知，血漿、組織樣品中無內源性物質或其他雜質干擾，專屬性良好，可滿足生物樣品測定要求。

2.5.2 線性關系考察 取50 μL大鼠空白血漿/組織勻漿樣品9份，加入“2.2”項下對照品溶液各50 μL，制成含0.5、1.0、2.6、5.2、10.0、26.0、52.0、260.0、520.0 ng/mL大黃素的樣品溶液，按“2.4”項下方法處理，在“2.3”項條件下進樣測定；質控樣品制備方法同標準曲線，低、中、高質量濃度分別為2.6、26.0、260.0 ng/mL。以待測物與內標峰面積比值為縱坐標(Y)，對照品質量濃度為橫坐標(X)進行回歸，結果見表1，可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

表1 大鼠血漿/組織中大黃素線性關系

2.5.3 準確度、精密度試驗 取2.6、26.0、260.0 ng/mL質控樣品溶液各5份，連續3 d在“2.3”項條件下進樣測定，結果見表2，可知該方法準確可靠，重復性好，符合生物樣品檢測要求。

表2 大黃素準確度、精密度試驗結果(n=6)

2.5.4 穩定性試驗 取2.6、26.0、260.0 ng/mL質控樣品溶液各5份，按“2.4”項下方法處理，在“2.3”項條件下進樣測定，分別考察大黃素在-20 ℃下反復凍融3次、-80 ℃下冷凍保存30 d、室溫下放置12 h的穩定性，結果見表3，可知該方法穩定性良好，符合生物樣品檢測要求。

表3 大黃素穩定性試驗結果(n=6)

2.5.5 提取回收率、基質效應試驗 取2.6、26.0、260.0 ng/mL質控樣品溶液，在“2.3”項條件下進樣測定，得峰面積A；取空白血漿/組織適量，按“2.4”項下方法處理(不加內標)，上清液中加入相應質量濃度的對照品、內標溶液，在“2.3”項條件下進樣測定，得峰面積B；向50%乙腈中加入相應質量濃度的對照品、內標溶液，在“2.3”項條件下進樣測定，得峰面積C，以(A/B)×100%計算提取回收率，(B/C)×100%計算基質效應，結果見表4，可知提取回收率良好，基質效應范圍97.3%～101.3%，符合生物樣品檢測要求。

表4 大黃素提取回收率、基質效應試驗結果(n=6)

2.6 藥動學研究 12只大鼠隨機分成2組，每組6只，給藥前12 h禁食不禁水，1組灌胃給予大黃素混懸劑，劑量為10 mg/kg，另1組灌胃給予相同劑量大黃素納米結構脂質載體混懸劑，于給藥前及給藥后0.083、0.25、0.5、1、2、4、6、8、10、12、24 h眼眶靜脈竇取血各約0.3 mL，血液樣品置于預先肝素化的1.5 mL離心管中，4 ℃、12 000 r/min離心5 min，取上層血漿，采用UPLC-Q-Orbitrap HRMS法測定大黃素血藥濃度，繪制血藥濃度-時間曲線，見圖2。再通過DAS 2.0軟件進行非房室模型擬合，SPSS 19.0軟件進行統計學分析，藥動學參數見表5，可知納米結構脂質載體Cmax是原料藥的1.39倍，相對生物利用度為182.98%，同時t1/2、MRT延長(P<0.01)，有助于發揮其長效緩釋作用。

表5 大黃素主要藥動學參數

圖2 大黃素血藥濃度-時間曲線

2.7 體內組織分布研究 取24只大鼠，按“2.6”項下方法分組給藥，分別于灌胃0.5、1.5、3、6 h后腹腔注射水合氯醛麻醉，每個時間點3只，再立即處死，取心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟，生理鹽水洗滌至各組織表面無血色，濾紙將水分吸干，置于冷凍管中，液氮速凍15 min，-80 ℃下保存待用，采用UPLC-Q-Orbitrap HRMS法測定大黃素含量，結果見圖3。由此可知，大黃素含量在肝臟中最高，其次在肺臟中，脾臟中最低；大鼠給予原料藥0.5 h后，該成分在肝臟中的含量高于給予納米結構脂質載體后，隨著時間的推移逐漸逆轉，而且后者下降速度明顯慢于前者，表明納米結構脂質載體在大鼠肝臟中具有一定的緩釋靶向作用。

圖3 大鼠各組織中大黃素含量

3 討論

血漿樣品常用的前處理方法有液-液萃取、固相萃取、蛋白沉淀，其中蛋白沉淀重復性好，成本較低，是蒽醌類成分生物樣品預處理的常用手段[15-16]。本實驗考察了甲醇、乙腈、乙酸乙酯對大黃素的提取回收率的影響，發現甲醇去除蛋白時雜質干擾少，提取回收率較高，符合生物樣品測定要求。

藥動學結果顯示，大黃素混懸液Cmax為75.81 ng/mL，而其納米結構脂質載體為105.77 ng/mL，可能是因為納米結構脂質載體粒徑較小，增加了與胃腸道黏膜的接觸面積，有利于藥物吸收；在大黃素納米結構脂質載體中加入磷脂、泊洛沙姆188時，可提高胃腸道黏膜通透性，促進藥物吸收[17]，從而增加Cmax；兩者AUC0～∞分別為398.56、729.27 ng/mL·h，相對生物利用度為182.98%，表明藥物吸收程度大大提高；兩者t1/2分別為9.06、2.36 h，體現了大黃素納米結構脂質載體的緩釋效應。