葒草苷調節微管穩定以促進脊髓損傷后軸突再生

錢 浩， 林 芝#， 周佳瑛， 賴嘉新， 吳志炫， 黃 溶， 黃蕾蕾， 董晨琳，陳子怡， 王 特*

(1.溫州醫科大學附屬第二醫院，溫州醫科大學育英兒童醫院，浙江 溫州 325027；2.溫州醫科大學第一臨床醫學院，溫州醫科大學信息與工程學院，浙江 溫州 325035；3.溫州醫科大學仁濟學院，浙江 溫州 325035)

脊髓損傷(spinal cord injury, SCI)預后不良并伴有一系列并發癥[1]。與周圍神經系統或胚胎期的中樞神經系統不同，成年哺乳動物的中樞神經系統在發生損傷后，軸突再生極為有限[2-3]。軸突再生障礙主要由神經元發育成熟過程中本身生長動力的減弱以及損傷后抑制性細胞微環境的形成所導致，這也是脊髓損傷預后不良的關鍵與治療的難點[4]。近年來，細胞骨架動力學作為軸突再生的關鍵因素受到廣泛關注。微管作為細胞骨架的關鍵組分，在正常神經元中，其結構穩定，平行排列并聚集成束，并延伸至軸突末端參與組成生長錐，進而參與軸突生長[5]；而脊髓損傷后，微管的穩定性被打破，軸突再生被顯著抑制[6]。多項研究表明，通過藥理作用增加微管穩定性能夠激活軸突再生潛能從而改善脊髓損傷后的運功功能，促進恢復，因此調節微管穩定性可作為脊髓損傷治療的重要研究方向[7-8]。葒草苷(Orientin，ORT)是一種C-糖基類黃酮，主要提取自剛竹屬竹葉、圣羅勒、西番蓮、烏蕨和金蓮花等藥用植物中。根據已有研究報道，葒草苷具有神經保護、抗心肌缺血、抗炎、抗氧化、抗凋亡等作用[9-12]。但葒草苷在脊髓損傷模型中尚未報道，其治療功能不明，作用機制不清。本研究發現：葒草苷給藥可以穩定微管以激活軸突再生潛能，從而促進脊髓損傷大鼠的運動功能恢復，表明葒草苷具有作為治療脊髓損傷候選藥物的潛力。

1 材料

1.1 動物 成年雌性SD大鼠8周齡，體質量220～230 g，共36只，購自中國科學院上海實驗動物中心(上海斯萊克實驗動物有限責任公司)，實驗動物生產許可證號SCXK(滬)2017-0005。

1.2 藥物與試劑 葒草苷(純度≥98%，CAS號28608-75-5，批號MUST-19071508)對照品購自成都曼思特生物科技有限公司。CCK-8試劑盒(貨號CA1210)、胰蛋白酶-EDTA消化液(貨號T1320)、DAPI復染試劑(貨號D8200)購自北京索萊寶科技有限公司；Hank’s緩沖液(貨號13150016)、DMEM/F-12培養基(貨號11320033)、神經元基礎培養基(貨號21103049)、TRIzol試劑(貨號15596018)、2% B27(貨號17504044)、0.5 mmol/LL-谷氨酰胺(貨號21051024)、胎牛血清(貨號10100147)購自美國Thermo Fisher Scientific公司；兔抗GAP43抗體(貨號ab16053)、兔抗Tuj-1抗體(貨號ab18207)、兔抗GAPDH抗體(貨號ab9485)、兔抗Ace-tubulin抗體(貨號ab179484)、兔抗GFAP抗體(貨號ab7260)購自英國Abcam公司；兔抗Tyr-tubulin抗體(貨號MAB1864-I)購自美國Sigma-Aldrich公司；BCA試劑盒(貨號P0012)購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.3 儀器 Thermo 8000系列水套式3429 CO2細胞培養箱、ABI QuantStudio5 實時熒光定量PCR儀(美國Thermo Fisher Scientifie公司)；Infinite M200 Pro多功能酶標儀(瑞士Tecan公司)；Western blot電泳儀、轉膜儀(美國Bio-Rad公司)；ECLIPSE 80i 共聚焦熒光顯微鏡(日本Nikon公司)。

2 方法

2.1 原代神經元細胞培養及氧糖剝奪模型建立 原代神經元提取自新生SD乳鼠，皮質與大腦剝離、清理血管后，將皮質組織剪切成小塊，置于預冷的Hank’s緩沖液中，在37 ℃下用0.125%胰蛋白酶-EDTA處理25 min，溶液用100 μm細胞過濾器過濾，1 000 r/min離心5 min。細胞沉淀重懸于完全DMEM/F-12培養基中，并放置在37 ℃下含5% CO2、空氣濕潤的培養箱中孵育，4 h后將培養基更換為含有2% B27、0.5 mmol/LL-谷氨酰胺的神經元基礎培養基，繼續在上述條件中培養，每隔3 d更換1次培養基。氧糖剝奪(OGD)處理細胞，模擬體外脊髓損傷，吸取神經元細胞原有的培養基，PBS洗3次，加入無糖DMEM培養基，置于三氣孵育培養箱[O2/CO2/N2(1%/5%/94%)]中處理，使細胞處于氧糖剝奪狀態，將神經元細胞置于氧糖剝奪(OGD)環境中作用6 h，同時不給予或給予不同濃度葒草苷處理48 h。根據以上處理因素將細胞分為空白對照組、OGD組、OGD+葒草苷組，進行CCK-8細胞增殖-毒性檢測、RT-qPCR、免疫熒光染色、Western Blot分析。

2.2 葒草苷細胞毒性檢測 將100 μL神經元懸液置于96孔板中，孵育24 h后，向各孔中加入不同濃度(0、2.5、5、10、25、50 μmol/L)葒草苷再孵育48 h，滴加10 μL CCK8溶液，將細胞與含90 μL培養基、10 μL CCK-8、100 μL CCK-8的混合物在37 ℃下培養2 h，在450 nm波長處測定吸光度，確定細胞活力。

2.3 RT-qPCR檢測 用OGD處理神經元細胞后，加入不同濃度(0、2.5、5、10、25、50 μmol/L)葒草苷，3 d后使用TRIzol試劑從神經元細胞中提取總RNA以合成cDNA。對樣品中Nefh、Gap43 mRNA表達進行分析，引物見表1。

表1 RT-qPCR引物序列

2.4 Western Blot檢測 分別向空白對照組、OGD組、OGD+葒草苷組神經元細胞中加入RIPA裂解緩沖液提取總蛋白，BCA試劑盒定量總蛋白，SDS-PAGE法分離出蛋白樣品(40 μg)并轉到PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉1.5 h，將膜與一抗在4 ℃下孵育過夜，加入anti-GAP43(1∶1 000)、anti-Ace-tubulin(1∶1 000)、anti-Tyr-tubulin(1∶500)、anti-GAPDH(1∶10 000)，在室溫下與相應二抗孵育1 h。條帶可視化由ChemiDoc XRS+成像系統完成，并通過Image Lab3.0軟件分析定量。

2.5 脊髓損傷大鼠模型建立及葒草苷給藥 將36只成年雌性SD大鼠隨機分為假手術組、脊髓損傷組、脊髓損傷+葒草苷給藥組，適應飼養1周后進行造模。腹腔注射8%水合氯醛(3.5 mL/kg)麻醉后備皮消毒，沿脊中線切開，通過椎板切除術暴露脊髓于T9椎體水平，暴露的脊髓用動脈夾(30 g)夾閉脊髓1 min；假手術組僅暴露脊髓而不夾閉。術后護理包括每天2次輔助排尿至膀胱功能恢復，并使用頭孢唑林鈉(50 μg/kg，腹腔注射)預防感染，同時在每天固定時段通過腹腔注射對脊髓損傷+葒草苷給藥組大鼠給予葒草苷(25 mg/kg)，持續28 d。所有外科手術和術后動物護理均經溫州醫科大學倫理委員會批準，操作均符合《實驗動物飼養管理和使用指南》。

2.6 免疫熒光染色 4%多聚甲醛分別固定空白對照組、OGD組、OGD+葒草苷組神經元細胞20 min后，PBS清洗3次，每次5 min。從飼養28 d的脊髓損傷組以及脊髓損傷+葒草苷給藥組的大鼠中分離得到脊髓組織(損傷中心兩側各保留1 cm)，在4%多聚甲醛中固定24 h，乙醇脫水后石蠟包埋切片(厚度5 μm)，在37 ℃下用5% BSA封閉液封閉細胞及切片30 min，在4 ℃下與一抗孵育過夜，加入anti-Tuj-1(1∶1 000)、anti-Ace-tubulin(1∶1 000)、anti-Tyr-tubulin(1∶500)、anti-GFAP(1∶500)，孵育后以PBST漂洗3次, 在37 ℃下與相應二抗孵育60 min，繼續用PBST洗滌，與DAPI溫育后封片。所有圖像均用共聚焦熒光顯微鏡進行捕獲，通過Image J圖像分析軟件對神經元軸突長度進行定量分析，測量每個神經元最長的神經突，每個圖像平均選擇10個代表性神經元，每個條件選擇4個代表性圖像。

2.7 行為學評價 為了評價脊髓損傷后的恢復特征，由2名對實驗條件不知情、訓練有素的研究人員進行行為學評價。Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)量表評分和斜板實驗評分選擇在造模后的第0、1、7、14、28天進行，其中前者是將大鼠置于空曠場地，2名觀察者根據其肢體和關節運動、肢體協調性、穩定性、尾巴位置、腹部位置的組合給出0～21分的評分；后者是將大鼠放在1塊覆蓋有橡膠墊的光滑木板上，斜板可繞其底部旋轉，體軸平行于板的垂直軸，之后逐漸增大斜板與水平面間夾角，當大鼠恰好在斜板上停留5 s時記錄角度。每只大鼠重復5次。

3 結果

3.1 葒草苷對原代神經元的細胞毒性作用 葒草苷分子結構見圖1A，本實驗在原代神經元中加入不同濃度(0、2.5、5、10、25、50 μmol/L)該成分并孵育48 h，結果見圖1B。由此可知，各組吸光度均無顯著差異(P>0.05)，提示葒草苷在0～50 μmol/L濃度范圍內對原代神經元無細胞毒性作用。

圖1 葒草苷對原代神經元的細胞毒性

3.2 葒草苷促進神經元軸突再生 本實驗將不同濃度(0、2.5、5、10、25、50 μmol/L)葒草苷與OGD處理神經元細胞進行培養，并以神經元軸突再生過程的關鍵蛋白——重肽神經絲蛋白(NEFH)、生長相關蛋白-43(GAP43)作為檢測指標，結果見圖2。由此可知，在3 d時葒草苷以劑量依賴性的方式使Nefh、Gap43 mRNA表達增加(P<0.05，P<0.01)，在25、50 μmol/L劑量下相較于對照組(0 μmol/L)差異明顯(P<0.01)，由于在50 μmol/L劑量下Nefh、Gap43 mRNA表達增加最高，故選擇其進行后續體外實驗(圖2A～2B)；與OGD組比較，OGD+葒草苷組神經元細胞GAP43蛋白表達增加(P<0.05)(圖2C～2D)；Tuj-1免疫熒光染色顯示，OGD+葒草苷組神經元軸突長度為(103.2±13.45) μm，而OGD組僅為(49.00±10.03) μm(圖2E～2F)，提示葒草苷能以劑量依賴性的方式促進神經元軸突再生。

注：與OGD組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.3 葒草苷調節原代神經元細胞微管穩定 本實驗以乙酰化微管蛋白(Ace-tubulin)、酪氨酸化微管蛋白(Tyr-tubulin)為指標，通過Western blot檢測其表達，結果見圖3。由此可知，相較于OGD組，OGD+葒草苷組上調了乙?；⒐艿鞍妆磉_(P<0.05)，降低了酪氨酸化微管蛋白表達(P<0.05)(圖3A～3C)；免疫熒光染色(圖3D～3F)顯示，葒草苷增強了乙?；⒐艿鞍谉晒鈴姸龋档土死野彼峄⒐艿鞍谉晒鈴姸?，使A/T比增加(P<0.01)，表明葒草苷可調節原代神經元細胞微管穩定性。

注：與OGD組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.4 葒草苷調節微管穩定，促進軸突再生 本實驗對脊髓組織切片進行免疫熒光染色，以GFAP標記星形膠質細胞，Ace-tubulin標記軸突，結果見圖4。由此可知，脊髓損傷后GFAP陽性星形膠質細胞在病灶邊緣積聚，而葒草苷增加了Ace-tubulin(+)面積，促進了軸突生長穿過病灶邊界并延伸至遠端區域，與體外實驗結果一致。

注：與脊髓損傷組比較，**P<0.01。

3.5 葒草苷促進脊髓損傷大鼠功能恢復 本實驗建立脊髓損傷大鼠模型后連續給藥28 d，分別于造模后0、3、7、14、28 d進行BBB量表評分及斜板實驗評分，結果見圖5。由此可知，造模后第0天除假手術組外，其他2組大鼠BBB量表評分為0，表示造模成功；第14天脊髓損傷+葒草苷給藥組的BBB量表評分為8.000分，脊髓損傷組評分為5.333分；第28天時2組評分分別為10.17、7.000分；第14、28天時脊髓損傷+葒草苷給藥組斜板實驗評分分別為34.17°、43.33°，高于脊髓損傷組的25.00°、30.83°(P<0.05，P<0.01)，提示葒草苷可促進脊髓損傷后功能恢復。

注：與脊髓損傷組比較，*P<0.05，**P<0.01。

4 討論

中樞神經系統損傷后的神經再生是脊椎動物自我修復能力的最大限制之一，也是當代生物醫學研究中最令人困擾且無法治療的挑戰之一。目前臨床上尚無副作用小、療效好的治療藥物，而脊髓損傷所帶來的社會負擔不容忽視，因此，能夠有效促進損傷脊髓結構以及功能恢復的藥物是迫切需要的。

葒草苷作為一種提取自天然中草藥的黃酮類單體化合物，具有副反應小、價格低等優點。有文獻報道葒草苷在腦缺血/再灌注損傷中具有神經保護作用[9]。同時，葒草苷能抑制過氧化氫(H2O2)誘導的神經元細胞的凋亡[13]。Guo等[14]亦報道過，葒草苷作為一種神經保護劑，在脊神經結扎模型中可用于神經性疼痛的治療。研究證明，多種黃酮類化合物能夠調節軸突再生：如English等[15]發現7,8-二羥基黃酮作為原肌球蛋白受體激酶B的小分子激動劑，能促進周圍神經損傷后的軸突再生；Wang等[16]證明了槲皮素可以促進急性脊髓損傷后的軸突再生?；谏鲜?，本實驗猜測葒草苷可能作用于脊髓損傷。

盡管改善脊髓損傷恢復涉及各種各樣的因素，但促進軸突再生被認為最有潛力，也是最有可能逆轉癱瘓的因素[17]。有研究表明通過調節神經元內在信號、調節神經元外部微環境、生物支架植入等方法促進軸突生長以改善脊髓損傷后功能的恢復[18]。本研究發現葒草苷可以顯著增加Nefh、GAP43等軸突再生過程中關鍵蛋白的mRNA和(或)蛋白表達，同時通過Tuj-1免疫熒光染色直觀地反映了葒草苷處理可以增加氧糖剝奪神經元的軸突長度，提示其能夠促進軸突再生。

微管是細胞骨架的關鍵組分，在正常神經元中，其結構穩定，平行排列并聚集成束，并延伸至軸突末端參與組成生長錐，進而參與軸突生長[5]。多項體內實驗表明，成年哺乳動物中樞神經系統神經元在損傷后無法重建功能性生長錐[19-21]；然而外周神經系統神經元可以再生出功能性的活動末梢[22]。兩者的主要差異在于損傷部位的細胞骨架的微管結構：小鼠坐骨神經損傷后，生長錐的大小仍恒定，微管保持了典型的束狀結構；而脊髓損傷后，微管的穩定性被打破，其排列變得雜亂無章且在細胞內分布不均，生長錐轉化為腫脹的、無生長能力的回縮泡結構[23]。微管穩定除了上文所述的具有調節軸突尖端由回縮泡結構向生長錐轉變的作用外，其對于調節損傷軸突再生的啟動至少還包括以下兩方面：一是神經元的極化受微管穩定性狀態的調控[24]；二是微管穩定在軸突再生所需細胞器(例如線粒體)、蛋白質(例如肌動蛋白)等的定向運輸過程中起重要作用[25]。Ertürk等[22]報道使用微管解聚藥物諾考達唑處理背根神經節神經元后，可將微管分散，軸突尖端轉變為類似于中樞神經系統損傷后的回縮泡結構。相反，通過埃坡霉素B、紫杉醇等藥理性微管穩定作用，可增強軸突尖端處的微管聚合，以促進神經元的極化與再生[7, 26]。因此，恢復微管的穩定性是促進脊髓損傷后軸突再生與功能恢復的重要途徑。在原代神經元細胞中，本研究通過Western blot及免疫熒光等實驗，發現葒草苷可以上調乙?；⒐艿鞍椎谋磉_，同時降低酪氨酸化微管蛋白的表達，增加A/T比值，提高微管的穩定性，從而促進軸突再生。脊髓組織切片的免疫熒光實驗亦支持了上述結果。同時，與埃坡霉素B、紫杉醇等抗腫瘤藥物比較，葒草苷作為天然中草藥提取物，其副反應小且價格較低，具有獨特的優勢。

最后利用急性脊髓損傷傷動物模型，本實驗進一步評估了葒草苷在實驗動物體內能否發揮作用，發現與對照組比較，進行葒草苷給藥的大鼠BBB評分及斜板評分均增加，表明葒草苷可改善脊髓損傷大鼠運動功能。

總而言之，本研究表明葒草苷通過穩定微管以促進軸突再生，最終改善脊髓損傷后大鼠運動功能，這為治療脊髓損傷提供了新的策略，也為天然中草藥在脊髓損傷治療中的應用提供了一定參考。但葒草苷如何增加微管穩定性或是否存在其他機制促進軸突再生，仍需進一步研究。