UPLC-MS法同時測定馬兜鈴果皮及種子中5種成分

高昌琨， 高玉菊， 張 楠， 胡 蝶

(1.安徽醫科大學第一附屬醫院藥劑科，國家中醫藥管理局中藥化學三級實驗室，安徽 合肥 230022；2.安徽中醫藥大學第二附屬醫院藥劑科，安徽 合肥 230061)

馬兜鈴為馬兜鈴科植物北馬兜鈴或馬兜鈴的干燥成熟果實，前者主要分布在東北、華北等地，后者分布于河南、山東及江南地區，其主要成分為馬兜鈴酸類。自1993年以來，陸續有馬兜鈴酸導致終末期腎病(ESRD) 及上尿路上皮癌(UUC) 等嚴重不良反應的報道[1-3]，對藥材中馬兜鈴酸類成分進行嚴格的含量控制對于相關藥材和復方的質量安全尤為重要。

馬兜鈴酸為硝基菲類羧酸化合物，主要有馬兜鈴酸A、B、C、D[4-6]，文獻已有對以上4種成分同時進行含量監控的報道[7-9]，或者檢測馬兜鈴總酸的含量[10-12]。馬兜鈴內酰胺為馬兜鈴酸在人體內的代謝物，可以和DNA結合形成難以降解的加合物，持續損害人腎小管，因此也具有和馬兜鈴酸相似的腎臟毒性[13-16]。本實驗采用UPLC-TOF/MS首次對馬兜鈴中5種毒性成分同時進行定量測定，從馬兜鈴酸類和內酰胺類兩大類毒性成分更全面評價馬兜鈴相關藥材的毒性，以期為其合理安全使用提供數據支撐。

此外，馬兜鈴種子和果皮中馬兜鈴酸類成分含量差異較大[11]，本實驗通過收集多批馬兜鈴主產地藥材，通過分別測定果皮和種子中相應5種成分的含量及加合量，探討馬兜鈴藥材區分用藥部位(以果皮入藥)入藥的可能性。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260系列高效液相色譜、Agilent 6520四級桿飛行時間(Q-TOF)質譜儀(美國安捷倫公司)；KQ2200B 超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)；BT25S電子天平(德國賽多利斯科學儀器有限公司)；Milli-Q純水器(美國Millpore公司)。

1.2 試劑與藥物 藥材信息見表1，經安徽中醫藥大學金傳山教授鑒定為北馬兜鈴AristolochiacontortaBge. 或馬兜鈴AristolochiadebilisSieb. et Zucc.的干燥成熟果實，區分為果皮和種子部位。對照品馬兜鈴酸A、B、C、D及馬兜鈴內酰胺均購于上海詩丹德標準技術服務有限公司，純度大于98%。乙腈(色譜純，美國Fisher公司)；甲酸(色譜純，國藥集團化學試劑有限公司)；水為Millpore Milli-Q超純水。

表1 樣品信息

2 方法與結果

2.1 溶液配制

2.1.1 對照品溶液 稱取5種對照品適量，精密稱定，置于5 mL量瓶中，加甲醇溶解，定容，搖勻，即得貯備液，混合并稀釋成25、6.25、1.5、0.8、0.4、0.2、0.05 μg/mL的溶液，即得。

2.1.2 供試品溶液制備 稱取馬兜鈴果皮1 g,加入80%甲醇-0.1%甲酸10 mL,超聲提取2次，每次30 min，12 000 r/min離心10 min，取上清液，用水稀釋4倍。HPD-100樹脂小柱(3 mL)先用5 mL甲醇活化，再用5 mL水平衡。馬兜鈴提取液以3 mL/min體積流量上樣，先用5 mL水洗脫除雜，再用5 mL 80%甲醇洗脫，收集80%甲醇洗脫流分，N2吹干，80%甲醇-0.1%甲酸反溶，0.22 μm微孔濾膜過濾，取續濾液，即得。

2.2 方法學考察

2.2.1 色譜條件 Zorbax C18色譜柱(2.1 mm×100 mm, 1.8 μm)；流動相0.1%甲酸(A)-乙腈(B)；梯度洗脫(0～2 min，5%B；3～14 min，5%～95%B；14～14.5 min，95%～5%B；14.5～17 min，5%B；體積流量0.3 mL/min；柱溫40 ℃；進樣量3 μL。

2.2.2 質譜條件 ESI離子源；正離子模式檢測；噴嘴電壓500 V；霧化氣壓力35 psi(1 psi=6.895 kPa);氮氣體積流量8 L/min; 干燥氣溫度300 ℃；鞘氣體積流量10 L/min; 鞘氣溫度300 ℃。定量離子見表2。數據分析采用 Agilent MassHunter Qualitative Analysis軟件(Version B.04.00)。

表2 5種成分定量離子(正離子模式)

2.2.3 系統適用性考察 精密吸取對照品、供試品適量，在“2.2.1”“2.2.2”項條件下進行分析，結果見圖1，可知5種成分與相鄰峰得到很好地分離。

1.馬兜鈴酸C 2.馬兜鈴酸D 3.馬兜鈴酸B 4.馬兜鈴內酰胺 5.馬兜鈴酸A

2.2.4 線性關系考察 取“2.1.1”項下對照品溶液，在“2.2.1”“2.2.2”項條件下進樣3 μL分析。以質量濃度為橫坐標(X),峰面積為縱坐標(Y)進行回歸，結果見表3，可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

表3 各成分線性關系

2.2.5 精密度試驗 精密吸取“2.1.1”項下0.8 μg/mL對照品溶液，在“2.2.1”“2.2.2”項條件下進樣4次，連續測定3 d，測得馬兜鈴酸A、B、C、D及馬兜鈴內酰胺日內精密度RSD分別為1.87%、10.00%、3.43%、3.92%、3.64%，日間精密度RSD分別為7.21%、16.12%、7.33%、7.36%、17.43%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩定性試驗 取“2.1.2”項下供試品溶液，在“2.2.1”“2.2.2”項條件下于0、4、8、12、24 h進樣，測得馬兜鈴酸A、B、C、D及馬兜鈴內酰胺峰面積RSD分別為5.29%、14.03%、6.96%、9.69%、12.75%，表明溶液在24 h 內穩定性良好。

2.2.7 重復性試驗 取同一批藥材粉末6份，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.2.1”“2.2.2”項條件下進樣，測得馬兜鈴酸A、B、C、D及馬兜鈴內酰胺含量RSD分別為4.43%、13.23%、6.98%、5.08%、7.62%，表明該方法重復性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗 精密稱取各成分含量已知(1號)的種子粉末6份，每份約0.5 g, 精密加入適量對照品溶液，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.2.1”“2.2.2”條件下進樣，計算回收率，結果見表4。

表4 各成分加樣回收率試驗結果(n=6)

2.3 樣品含量測定 取各藥材適量，按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，在“2.2.1”“2.2.2”項條件下進樣，標準曲線法計算含量，結果見表5。由此可知，14批藥材中果皮所含5種成分平均總含量為(2.86±1.03)μg/g，而種子為(156.23±58.31)μg/g，兩者相差約50倍。

表5 各成分含量測定結果

3 討論

馬兜鈴，尤其是種子中含有較多的脂肪，需要對樣本進行預處理凈化后才能采用質譜進行分析。一般預處理方法多采用C18SPE 小柱，但價格較為昂貴且容易堵塞萃取柱，而采用價廉易得的HPD-100樹脂作為預處理凈化方法，可以達到類似的效果并可反復使用，節約分析檢測成本。

本實驗采用質譜提取離子(EIC)方式進行定量，其中文獻[7]報道馬兜鈴酸類成分的一級質譜出現多種加合離子，如馬兜鈴酸A包括m/z705.1[2 M+Na]+、m/z364.1[2 M+Na]+、m/z298.1[M+H-CO2]+，以及較弱的m/z342.1[M+H]+, 加合離子較多不利于取得更高的靈敏度，優化質譜條件后，馬兜鈴酸A產生較強及相對單一的m/z364.1[2 M+Na]+，因此，選擇該離子作為定量離子。

文獻報道，不同產地的馬兜鈴藥材中馬兜鈴酸A的含量差異巨大，在460.73～1 039.46 μg/g之間；本實驗發現馬兜鈴果皮和種子中不但5種成分差異明顯，其總含量更是相差約50倍之多(果皮小于種子)，實際應用中種子取樣量小更容易導致取樣不均，更加增大了安全用藥風險。2020年版《中國藥典》由于馬兜鈴的毒性已刪去該品種，但保留含有馬兜鈴的復方品種31項，為進一步降低使用馬兜鈴復方的風險，建議馬兜鈴藥材區分用藥部位(以果皮入藥)入藥。