復方黑骨藤有效組分抗類風濕性關節炎作用及分子機制

李佳俊， 張 宏,2， 李克娟， 陳 秀， 李 琪,2*

(1.四川師范大學生命科學學院，四川 成都 610101；2.四川師范大學植物功能基因組及生物信息學研究中心，四川 成都 610101)

類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以關節滑膜炎為主要特征的自身免疫疾病，其病理學改變包括滑膜增生、軟骨破壞及血管翳形成等。該病病程較長，可發生在各個年齡段，并以女性多見[1]，其高致殘性嚴重影響了患者的正常生活。復方黑骨藤由黑骨藤、秦艽、延胡索3味中藥組成，具有清熱解毒、活血化瘀之功效，是民間用于治療RA的經典方劑。目前對于復方黑骨藤治療RA的藥理研究大多集中在粗提物層面，難以闡明藥物發揮治療作用的物質基礎和作用模式。本課題組在前期實驗已分別篩選出黑骨藤、秦艽、延胡索各單味藥的抗炎有效部位，并測定了各抗炎有效部位的純度，均在45%以上[2-4]。在此基礎上，結合中藥復方有效成分組學[5]的研究思路，本實驗將該復方中各單味藥有效部位以適當比例重新混合為復方黑骨藤有效組分(the effective components ofPeriplocaforrestiiSchltr. Compound，EC-PFSC)，擬通過小鼠耳腫脹和足腫脹兩種急性炎癥模型進行EC-PFSC最優抗炎劑量篩選，再選用與人類RA病理變化高度相似的膠原誘導性關節炎(collagen-induced arthritis，CIA)動物模型[6]，觀察其治療作用并結合絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)信號通路中關鍵蛋白及相關炎癥介質的表達，進一步探討EC-PFSC抗RA的可能分子作用機制，為該藥物的深入開發和臨床應用提供理論依據。

1 材料

1.1 藥材與藥物 黑骨藤于2017年購于西昌藥材市場，秦艽(批號20180527)、延胡索(批號20180629)購于北京同仁堂，經四川師范大學嚴偉教授鑒定均為正品。雷公藤多苷片(批號20180501，10 mg/片，遠大醫藥黃石飛云制藥有限公司)。

1.2 試劑 對照品新綠原酸、綠原酸、延胡索乙素、異綠原酸C、脫氫紫堇堿、延胡索甲素、原阿片堿均購于成都瑞芬思生物科技有限公司，隱綠原酸、原花青素A1、原花青素A2均購于深圳市斯坦德合成有限公司，馬錢苷酸、6′-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷、龍膽苦苷、杠柳毒苷均購于成都普思生物科技有限公司。二甲苯(成都市科龍化工試劑廠，批號20150125)；角叉菜膠(批號22049-5G-F)、弗氏完全佐劑(F5881)均購于美國Sigma公司；PBS緩沖液(批號ZLI-9062)、生物素化山羊抗兔IgG二抗(貨號SP-9001)均購于北京中杉金橋生物技術有限公司；前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)試劑盒(上海邦奕生物科技有限公司，批號201903)；一氧化氮(nitric oxide，NO)試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號20190327)；牛Ⅱ型膠原蛋白(上海源葉生物科技有限公司，批號S12008)；兔多克隆誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)抗體(武漢愛博泰克生物科技有限公司，貨號A0312)；兔多克隆抗體caspase3(批號GB11009-1)、β-actin(貨號GB12001)、兔多克隆環氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)抗體(貨號GB11077-2)、HRP標記山羊抗兔(貨號GB23303)、HRP標記山羊抗小鼠(貨號GB23301)、5×蛋白上樣緩沖液(貨號G2013)、磷酸化蛋白酶抑制劑(貨號G2007)、RNA提取液(貨號G3013)、SYBR? Green Fast qPCR Mix(貨號G3008)均購于武漢賽維爾生物科技有限公司；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(貨號#K1622)、蛋白Marker(貨號26616)均購于美國Thermo公司；磷酸化細胞外信號調節激酶(phosphorylated extracellular signal-regulated kinase，P-ERK)抗體(貨號4370)、磷酸化p38(phosphorylated p38，P-p38)抗體(貨號4511)均購于美國CST公司；D-101大孔樹脂(天津市光復精細化工研究所)。甲醇為色譜純；乙醇、磷酸為分析純。

1.3 動物 SPF級昆明種小鼠，雌雄各半，體質量(18±2)g，4周齡；SPF級Wistar大鼠，雄性，體質量(120±10)g，5周齡，購自成都達碩實驗動物有限公司，實驗動物生產許可證號SCXK(川)2015-030。分籠飼養，室溫(22±2)℃，相對濕度60%～65%，定時換氣，自由進食飲水。

1.4 儀器 M01000101游標卡尺(成都量具刃具股份有限公司)；Model 680酶標儀(美國Bio-Rad公司)；RM2016轉輪式切片機(德國徠卡公司)；TSJ-Ⅱ全自動封閉式組織脫水機、PHY-Ⅲ病理組織漂烘儀(常州市中威電子儀器有限公司)；BMJ-Ⅲ包埋機(常州郊區中威電子儀器廠)；BA400Digital數碼三目攝像顯微鏡(麥克奧迪實業集團有限公司)；Stepone plus熒光定量PCR儀(美國ABI公司)；ACQUITY H-Class超高相液相色譜儀(美國Waters公司)；YRE-201D旋轉蒸發儀(予華儀器有限責任公司)；VIRTIS冷凍干燥機(美國Virtis公司)。

2 方法

2.1 藥物制備 分別取黑骨藤、秦艽、延胡索藥材適量，各采用50 ℃超聲、80 ℃回流、75 ℃超聲以1∶20、1∶20、1∶25的料液比加入50%乙醇提取，重復3次，每次1 h，再分別合并各提取液，過濾，濃縮，后分別上樣于D101大孔吸附樹脂，黑骨藤收集10個柱體積20%乙醇洗脫液，秦艽收集15個柱體積10%乙醇洗脫液，延胡索先收集10個柱體積30%乙醇洗脫液，再收集10個柱體積95%乙醇洗脫液，各藥物洗脫液分別減壓濃縮，冷凍干燥，即得黑骨藤有效部位干粉(得率4%)、秦艽有效部位干粉(得率9.94%)、延胡索有效部位干粉(得率2.51%)。參照課題組前期所篩選的最佳抗炎藥液質量濃度[黑骨藤有效部位(4.57 mg/mL)、秦艽有效部位(50 mg/mL)、延胡索有效部位(0.96 mg/mL)]，將黑骨藤、秦艽、延胡索各有效部位干粉以4.8∶52.1∶1的質量比用蒸餾水配制成EC-PFSC高劑量組藥液(55.53 mg/mL)，即3種有效部位的終質量濃度均為其最佳抗炎藥液濃度，再依次用蒸餾水半倍稀釋配制成中劑量(27.80 mg/mL)、低劑量(14.05 mg/mL)組藥液，4 ℃冰箱保存備用。將黑骨藤、秦艽、延胡索以2.5∶1∶1的比例混勻，打磨成粉，過篩，50%乙醇80 ℃回流提取3次(料液比1∶40)，每次1 h，合并提取液，減壓濃縮，冷凍干燥，即得傳統復方黑骨藤提取物干粉。稱取適量用蒸餾水配制成給藥所需濃度的傳統復方黑骨藤藥液，4 ℃冰箱保存備用。另取雷公藤多苷片適量，加蒸餾水配制成4.0 mg/mL藥液，于4 ℃冰箱中保存備用。

2.2 EC-PFSC劑量篩選

2.2.1 對二甲苯致小鼠耳腫脹的作用 取小鼠84只，雌雄各半，適應性飼養5 d后，將動物隨機分為空白組、模型組、雷公藤組(40.0 mg/kg)、傳統復方黑骨藤組(322.0 mg/kg，以傳統復方黑骨藤提取物干粉重量計)及EC-PFSC高、中、低劑量(555.3、278.0、140.5 mg/kg，以混合有效組分干粉重量計)組，每組12只(雌雄各半)。各給藥組對應給藥，空白組、模型組給予生理鹽水；各組灌胃給藥容量均為10 mL/kg，每天1次，連續7 d。除空白組外，末次給藥1 h后，每只小鼠右耳前后兩面涂50 μL二甲苯致炎，左耳作對照。30 min后將小鼠斷頸處死，剪下左右耳，在同一位置用打孔器打下等大的圓形耳片，稱定質量，計算耳腫脹度和耳腫脹抑制率。耳腫脹度=右耳質量-左耳質量，耳腫脹抑制率=[(模型組平均腫脹度-給藥組平均腫脹度)/模型組平均腫脹度]×100%。

2.2.2 對角叉菜膠致小鼠足腫脹的作用 分組與灌胃劑量參考“2.2.1”項。除空白組外，末次給藥1 h后，每只小鼠右后足中部皮下注射30 μL 1%角叉菜膠致炎。致炎4 h后，用游標卡尺測量小鼠右后足腫脹厚度，計算足腫脹率和足腫脹抑制率。足腫脹率=[(造模后右后足厚度-造模前右后足厚度)/造模前右后足厚度]×100%，足腫脹抑制率=[(模型組平均足腫脹率-給藥組平均足腫脹率)/模型組平均足腫脹率]×100%。

2.2.3 ELISA法檢測小鼠致炎足中PGE2和NO水平 “2.2.2”項下操作完成后，迅速剪下小鼠致炎足，剝皮、剪碎后用勻漿機粉碎，在生理鹽水中浸泡1 h，離心，取上清，按照ELISA試劑盒說明書測定PGE2、NO水平。

2.3 EC-PFSC對CIA大鼠的作用

2.3.1 造模、分組及給藥 取健康雄性大鼠50只，適應性飼養7 d后，隨機選10只作為空白組。其余參照文獻[7]建造CIA模型。造模成功的大鼠隨機分為模型組、雷公藤組(40.0 mg/kg)、傳統復方黑骨藤組(230.0 mg/kg，以傳統復方黑骨藤提取物干粉重量計)、EC-PFSC組(194.6 mg/kg，以混合有效組分干粉重量計)，每組10只，其中2個實驗組劑量分別由小鼠傳統復方黑骨藤組和EC-PFSC中劑量組按人和動物間體表面積換算為大鼠劑量而得。造模21 d后，各給藥組對應給藥，空白組、模型組給予生理鹽水，各組灌胃給藥容量均為10 mL/kg，每天1次，連續28 d。

2.3.2 一般指標檢測 于造模前一天及造模后第7天開始，用游標卡尺測量大鼠右足趾厚度(它與左足趾厚度的差值作為腫脹度，mm)，每隔7 d記錄腫脹情況及體質量。

2.3.3 關節炎指數(arthritis index，AI)評分 造模后第7天開始，定期觀察并記錄全身關節病變程度，每4 d 1次，按5級評分法評價[8](0分，無紅腫；1分，趾關節紅腫；2分，趾關節和足趾腫脹；3分，趾關節以下的足爪腫脹；4分，包括踝關節在內的全部足爪腫脹)，將4個關節的積分累計起來，即為每只大鼠的AI。

2.3.4 免疫組化法檢測caspase3表達 于實驗第49天后處死各組大鼠，無菌條件下取右踝關節，剔除多余的肌肉組織，10%甲醛固定，脫水，包埋，切片。按照免疫組化試劑盒操作步驟檢測caspase3表達。免疫組化切片底色為白色，陽性表達為淺黃色或棕黃色(表達于細胞漿、細胞膜，或間質)，陰性表達為藍色。圖像采集(BA200Digital 數碼三目攝像顯微攝像系統)為100倍下觀察全部組織，400倍下選取1個視野采集圖像。圖像的平均光密度通過Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統測定，每張切片隨機選取3個視野取其平均值。

2.3.5 Western blot法檢測iNOS、COX-2、P-ERK、P-p38蛋白表達 取研碎后的大鼠右踝關節適量，加10倍組織體積裂解液勻漿，冰上裂解，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，收集上清，BCA法測定蛋白濃度，SDS-PAGE電泳分離總蛋白，轉移到PVDF膜，封閉1 h后，分別加入相應一抗，4 ℃過夜。TBST洗滌3次，每次10 min，加入二抗(1∶3 000)，室溫孵育30 min，TBST洗滌3次，每次10 min，加入ECL，使膜與顯色液充分接觸反應1～2 min，凝膠成像系統拍照分析。Alpha軟件處理系統分析目標帶的光密度值，結果以目的蛋白與內參蛋白灰度值的比值表示。

2.3.6 RT-qPCR法檢測caspase3、iNOS、COX-2 mRNA表達 取研碎后的大鼠右踝關節100 mg，Trizol法提取總RNA，并測定其濃度與純度，取純度好的樣品按照說明書進行逆轉錄與PCR擴增試驗。PCR反應體系為25 μL，擴增條件為預變性95 ℃，10 min；循環(40次)95 ℃，15 s～60 ℃，60 s；熔解曲線60 ℃～95 ℃，每15 s升溫0.3 ℃，結果以β-actin基因作為內參，采用2-ΔΔCT法對基因表達進行相對定量分析。引物序列見表1。

表1 熒光定量PCR引物序列

2.4 UPLC法測定EC-PFSC中14種有效化合物

2.4.1 供試品溶液制備 分別稱取“2.1”項下黑骨藤、秦艽、延胡索各有效部位和傳統復方黑骨藤提取物干粉適量，50%甲醇各定容于10 mL量瓶，搖勻，過0.22 μm微孔濾膜，取續濾液，即得EC-PFSC組分溶液(1.10 mg/mL)和傳統復方黑骨藤提取物溶液(1.75 mg/mL)。

2.4.2 對照品溶液制備 精密稱取新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、馬錢苷酸、6′-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷、原花青素A1、原花青素A2、原阿片堿、延胡索乙素、異綠原酸C、脫氫紫堇堿、延胡索甲素、杠柳毒苷、龍膽苦苷對照品適量，加甲醇制成每1 mL分別含0.430、0.346、0.224、0.184、0.285、0.295、0.320、0.143、0.353、0.243、0.223、0.183、0.354、2.462 mg的溶液，搖勻，即得。

2.4.3 色譜條件 ACQUITY UPLC? BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；流動相磷酸(pH=3.0)(A)-甲醇(B)，梯度洗脫(0～10 min，95%～75%A；10～25 min，75%～60%A；25～30 min，60%～40%A；30～40 min，40%～0A)；體積流量0.3 mL/min；柱溫45 ℃；檢測波長221 nm；進樣量1 μL。

3 結果

3.1 EC-PFSC不同劑量對小鼠耳腫脹的影響 表2顯示，與模型組比較，雷公藤組、傳統復方黑骨藤組和EC-PFSC高、中劑量組均可降低小鼠耳腫脹度(P<0.01)，其中EC-PFSC高、中劑量組耳腫脹抑制率分別為30.46%和32.32%，與傳統復方黑骨藤組(31.90%)接近。

表2 EC-PFSC對二甲苯致小鼠耳腫脹的影響

3.2 EC-PFSC不同劑量對小鼠足腫脹的影響 表3顯示，與模型組比較，其他各組均可抑制小鼠足腫脹度(P<0.05，P<0.01)，其中EC-PFSC中劑量組抑制作用較好，腫脹抑制率可達29.42%，高于EC-PFSC高劑量組(19.62%)和傳統復方黑骨藤組(18.94%)。

表3 EC-PFSC對角叉菜膠致小鼠足腫脹的影響

3.3 EC-PFSC不同劑量對小鼠致炎足中PGE2、NO水平的影響 圖1顯示，與空白組比較，模型組和傳統復方黑骨藤組小鼠腫脹足組織中PGE2、NO水平均增加(P<0.05，P<0.01)，表明炎癥反應劇烈；與模型組和傳統復方黑骨藤組比較，EC-PFSC高、中劑量組小鼠腫脹足組織中PGE2、NO水平均降低(P<0.01)，其中EC-PFSC中劑量組PGE2、NO降低率分別為40%和20%，與雷公藤組PGE2、NO降低率相當。以上結果提示EC-PFSC中劑量組抗炎藥效最優，因此選擇278.0 mg/kg作為后續實驗劑量。

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01；與傳統復方黑骨藤組比較，△△P<0.01。

3.4 EC-PFSC對CIA大鼠體質量、足腫脹度、AI的影響 圖2顯示，二次致炎(第7天)前，各組大鼠體質量無明顯差異(P>0.05)，二次致炎(第7天)后至灌胃給藥(第21天)前，與空白組比較，各造模組大鼠體質量下降(P<0.01)，足腫脹度和AI評分升高(P<0.01)，表明造模成功。灌胃給藥(第21天)后，與模型組比較，傳統復方黑骨藤組和EC-PFSC組隨著給藥時間的增加均可在一定程度上緩解大鼠體質量的減輕、抑制足腫脹度的增加及降低AI評分，在第49天時，與傳統復方黑骨藤組比較，EC-PFSC組大鼠足腫脹度和AI評分降低(P<0.05)。以上分析結果提示EC-PFSC對CIA大鼠的關節炎有一定抑制效果，而且不良反應較小。

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01；與傳統復方黑骨藤組比較，△P<0.05。

3.5 EC-PFSC對CIA大鼠踝關節中caspase3蛋白和mRNA表達的影響 圖3顯示，與空白組比較，模型組大鼠踝關節中caspase3蛋白和mRNA表達均降低(P<0.01)；與模型組比較，EC-PFSC組大鼠踝關節中caspase3蛋白和mRNA表達升高(P<0.01)，其平均光密度值可達0.307，與空白組相當，且與傳統復方黑骨藤組比較，EC-PFSC組大鼠踝關節中caspase3蛋白和mRNA表達均升高(P<0.01)，提示EC-PFSC可升高CIA大鼠踝關節中caspase3蛋白和mRNA的表達。圖4顯示，各組CIA大鼠免疫組化切片可見caspase3陽性表達為黃色，陰性表達為藍色；空白組caspase3表達最高，其次是EC-PFSC組，而模型組表達明顯降低。變化規律與圖3A基本一致。

注：與空白組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01；與傳統復方黑骨藤組比較，△△P<0.01。

圖4 各組大鼠踝關節caspase3免疫組化染色(×400)

3.6 EC-PFSC對CIA大鼠踝關節中P-ERK、P-p38蛋白表達的影響 圖5顯示，與空白組比較，模型組大鼠踝關節中P-ERK、P-p38蛋白表達升高(P<0.01)；與模型組比較，EC-PFSC組、傳統復方黑骨藤組和雷公藤組大鼠踝關節中P-ERK、P-p38蛋白表達均降低(P<0.05，P<0.01)，其中EC-PFSC組大鼠踝關節中P-ERK、P-p38降低率分別達89%和47%，提示EC-PFSC可使CIA大鼠踝關節中過表達的P-ERK、P-p38蛋白水平得到有效恢復。

注：與空白組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。

3.7 EC-PFSC對CIA大鼠踝關節中iNOS、COX-2蛋白和mRNA表達的影響 圖6顯示，與空白組比較，模型組大鼠踝關節中iNOS、COX-2蛋白和mRNA表達升高(P<0.01)；與模型組比較，EC-PFSC組、傳統復方黑骨藤組和雷公藤組大鼠踝關節中iNOS、COX-2蛋白和mRNA表達均降低(P<0.05，P<0.01)，且與傳統復方黑骨藤組比較，EC-PFSC組大鼠踝關節中iNOS、COX-2蛋白表達均降低(P<0.05，P<0.01)，提示EC-PFSC可有效抑制CIA大鼠踝關節中iNOS、COX-2蛋白和mRNA的表達。

注：與空白組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01；與傳統復方黑骨藤組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

3.8 UPLC檢測分析結果 圖7顯示，在221 nm波長處，色譜峰雜質干擾較少，體現的信息最完整，分離效果最好。根據14種有效化合物最大吸收光譜，在不同波長條件下測定其峰面積，外標法計算含量。表4顯示，與傳統復方黑骨藤提取物比較，EC-PFSC組分中有效化合物總含量明顯升高，達49.03%，提示EC-PFSC組分達到了富集效果，其中環烯醚帖類化合物含量占比達40.73%。

1.新綠原酸 2.綠原酸 3.隱綠原酸 4.馬錢苷酸 5.6′-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷 6.原花青素A1 7.龍膽苦苷 8.原花青素A2 9.原阿片堿 10.延胡索乙素 11.異綠原酸C 12.脫氫紫堇堿 13.延胡索甲素 14．杠柳毒苷

表4 樣品中14種有效化合物總含量

4 討論

二甲苯致小鼠耳腫脹和角叉菜膠致小鼠足腫脹是兩種經典急性炎癥動物模型，常用以評價中藥抗炎活性，故本研究首先選用這兩種模型篩選EC-PFSC抗炎最佳劑量，該兩項實驗結果顯示EC-PFSC中劑量組減輕小鼠耳腫脹和足腫脹程度較明顯。PGE2可促進組織的紅、腫、熱、痛，具有血管擴張劑和增加血管通透性的作用[9]，是急性炎癥早期的典型病理改變[10]，NO過表達會引起組織和細胞損傷，加重炎癥反應[11]。因此，選擇PGE2、NO作為抗炎藥效篩選的評價指標，具有一定的代表意義。ELISA實驗結果顯示，EC-PFSC能抑制炎癥介質NO和PGE2的釋放，且EC-PFSC中劑量組協同增效作用最佳，這與前面小鼠耳腫脹和足腫脹實驗結果一致，故后續實驗選定EC-PFSC中劑量(278.0 mg/kg)進行抗RA機制研究。

caspase3通常以非活性酶原形式存在于細胞質中，在轉錄、翻譯等水平調控細胞凋亡，然而炎癥的發生與凋亡息息相關。當巨噬細胞吞噬、消化凋亡過程中形成的凋亡小體后，凋亡小體內容物則不會外溢，進而減輕炎癥反應[12]。免疫組化和RT-qPCR實驗結果顯示，EC-PFSC組caspase3蛋白和mRNA表達升高，且藥效優于傳統復方黑骨藤組，說明EC-PFSC可上調caspase3表達，促進細胞凋亡，從而起到炎癥保護作用。

MAPKs信號通路是細胞內信號轉導的關鍵途徑之一，活化后可介導胞外信號刺激傳入胞內，參與調節炎癥、凋亡、增殖和分化等多種重要生理過程[13]。ERK、p38和JNK是參與炎癥反應的主要MAPKs家族成員[14]，其中ERK和p38在真核細胞中主要以磷酸化形式存在，近年來作為RA潛在的重要信號分子受到關注。Western blot實驗結果顯示，EC-PFSC組P-ERK和P-p38蛋白表達下調，說明EC-PFSC可抑制ERK和p38的過度磷酸化，從而抑制MAPKs信號通路的激活，達到減緩炎癥發展的效果。

有毒介質NO的水平與炎癥疾病的發生密切相關，其表達受iNOS的調控，因此iNOS是炎癥過程中的關鍵酶[15]，炎癥反應檢測的一個重要指標[16]。COX-2一般在正常組織中活性較低，受到外界刺激時可快速應答一些促炎因子(如PGE2)，因此被認為是炎癥發生過程中的重要角色[17]。Western blot和RT-qPCR實驗結果顯示，EC-PFSC組可抑制iNOS、COX-2蛋白和mRNA的過表達，且EC-PFSC組對iNOS、COX-2蛋白表達的抑制作用優于傳統復方黑骨藤組，說明EC-PFSC可通過下調炎癥介質iNOS、COX-2的表達，以抑制炎性因子的產生，從而發揮抗炎作用。

相關藥理研究表明，綠原酸類、黃酮類、環烯醚帖類、生物堿類等有效成分對抗RA有促進作用[18-21]，且UPLC檢測結果發現EC-PFSC組分中14種有效化合物總含量高于傳統復方黑骨藤提取物，進一步驗證了富集之后的EC-PFSC對比傳統復方黑骨藤有更為顯著的抗炎藥效。

綜上，復方黑骨藤有效組分(EC-PFSC)對類風濕性關節炎有一定的治療作用，其作用機制可能與抑制MAPKs信號通路中ERK和p38的過度磷酸化，進而抑制下游分子iNOS、COX-2的高表達，降低炎癥因子的過量分泌，同時激活凋亡因子caspase3的表達，平衡細胞增殖與凋亡有關。