八角楓丸劑抗大鼠類風濕性關節炎的作用機制

徐李玲， 黃艷萍， 郭殊瑋， 梁寶賢， 蔣偉哲， 付書婕

(廣西醫科大學藥學院，廣西 南寧 530021)

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種常見的全身性自身免疫性疾病，以關節的慢性炎癥、軟骨和關節骨的破壞為特征，表現為類風濕結節、肺間質病變、Felty’s綜合征等一系列關節外表現[1-2]，是一種典型的慢性炎性自身免疫性疾病，主要表現為關節炎、滑膜增生、軟骨及骨破壞。目前，相關治療藥物包括非甾體類抗炎藥、甾體類抗炎藥、疾病修飾類抗風濕藥、生物制劑、中藥[3]。NF-κB信號通路參與類風濕關節炎的發病機制，它作為轉錄因子，通過激活和參與炎癥產生(如IL-1β、TNF-α等)來調節發病機理，從而影響本病炎癥進展[4-6]。

八角楓為八角楓科八角楓屬植物AlangiumChinese(Lour)Harms，其味辛溫[7-8]，主要成分為生物堿，烯、醇醚類、苷類等[9-11]，對中樞神經系統、心血管系統、平滑肌、呼吸系統均有良好的作用[12]。八角楓丸劑由廣西壯要方醫院醫療機構制劑室提供，具有鎮痛、消炎、抗風濕、肌肉松弛的作用[13-14]，主要用于類風濕性關節炎等疾病的治療。本實驗建立膠原誘導關節炎大鼠模型，研究八角楓丸劑抗類風濕性關節炎活性及其可能的作用機制。

1 材料

1.1 動物 SPF級雄性SD大鼠40只，體質量(150±20)g，由廣西醫科大學實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證號SCXK(桂)2014-0002，溫度控制在(23±2)℃，相對濕度控制在(50±10)%，適應性喂養1周。

1.2 藥物 八角楓丸劑(批號20190730，廣西壯要方醫院醫療機構制劑室自制)；雷公藤多苷片(批號20190401，湖南千金協力藥業有限公司)。

1.3 試劑 牛源性Ⅱ型膠原蛋白(批號190209，美國Chondrex公司)；弗氏不完全佐劑(批號SLBZ2765，美國Sigma公司)；羧甲基纖維素鈉CMC-Na(批號20180110，國藥集團化學試劑有限公司)；4%多聚甲醛溶液(批號P1110)、苯甲基磺酰氟化物PMSF(批號20190903)、RIPA裂解液(批號20190826)，均購自北京索萊寶科技有限公司；腫瘤壞死因子(TNF-α)、轉化生長因子(TGF-β1)、白介素1β(IL-1β)、白介素10(IL-10)ELISA試劑盒(批號均為20191220)，均購自于南京建成生物工程研究所；β-actin抗體(批號4970S)、Anti-rabbit IgG(H+L).(DyLightTM800 4×PEG Conjugate)(批號5151P)，均購自美國CST公司；NLRP3抗體(批號AB263899，英國Abcam公司)；TLR4抗體(批號ABS143411)、IRAK1抗體(批號ABS116547)，均購自上海愛必信生物科技有限公司。

1.4 儀器 冷凍離心機(MicroCL17R型，美國Thermo Fisher Scientific公司)；連續光譜掃描酶標儀(SpectraMaxPlus384型，香港分子儀器公司)；電泳儀(PowerPac HC型，美國Bio-Rad公司)；Odyssey紅外熒光掃膜成像系統(LI-COROdyssey CLx型，美國LI-COR公司)。

2 方法

2.1 八角楓丸劑的制備 稱取八角楓適量，加入10倍量蒸餾水煎煮提取2次，每次1 h，合并濾液，濃縮成稠膏，蒸干為干膏，取適量加入輔料(CMS-Na和淀粉)和潤濕劑(水)制丸，干燥，即得。

2.2 造模 將溶解于冰醋酸的牛源性Ⅱ型膠原蛋白加入等體積的弗式不完全佐劑，在冰浴條件下使兩者充分乳化(以乳化液滴入水中不擴散為度)，使用高速勻漿機充分混合均勻，轉速設置為3 000 r/min，時間間隔3 min，其間適時更換冰水混合物，保持離心管溫度在4 ℃左右，以免膠原變性，乳劑最終狀態應充分混勻，呈油包水狀。若未達到此效果需重復上述操作過程，最終質量濃度為1 mg/mL。在大鼠尾根部及足恥底部注射牛源性Ⅱ型膠原蛋白乳劑各0.1 mL，初次免疫后第7天，在大鼠尾根部、背部以相同劑量再次免疫[15]。

2.3 分組及給藥 造模成功后，將大鼠分為模型組、八角楓丸劑高(84 mg/kg)和低(21 mg/kg)劑量組、陽性藥(15 mg/kg雷公藤多苷)組、空白組，按10 mL/kg劑量灌胃給藥，模型組、空白組大鼠灌胃給予等量0.5%的CMC-Na，連續28 d。

2.4 檢測指標

2.4.1 足厚度 分別于致炎前(第0天)和致炎后第14、21、28、35、42天，用軟尺測量每只大鼠右后爪周長，游標卡尺測量右足肉墊厚度。

2.4.2 關節炎指數 參考文獻[16-17]報道，于致炎前(第0天)和致炎后第14、21、28、35、42天進行評分，標準為(1)0分，正常；(2)1分，踝關節出現紅斑和輕微腫脹；(3)2分，踝關節到跖關節或掌關節紅斑和輕微腫脹；(4)3分，踝關節到跖趾關節或掌關節出現紅斑和中度腫脹；(5)4分，踝關節到趾關節出現紅斑和重度腫脹。

2.4.3 免疫器官指數 各組大鼠禁食12 h，末次給藥1 h后腹腔注射水合氯醛麻醉，分離脾臟和胸腺，稱定質量，計算大鼠免疫器官指數，公式為脾臟或胸腺指數=(脾臟或胸腺質量/體質量)×103。

2.4.4 血清炎癥因子水平 各組大鼠禁食12 h，末次給藥1 h后腹腔注射水合氯醛麻醉，腹主動脈取血，3 000 r/min離心15 min，取血清，采用ELISA法檢測血清IL-1β、TNF-α、IL-10、TGF-β1水平。

2.4.5 組織病理學 大鼠脫頸處死，立即分離病變關節，4%多聚甲醛固定48 h，10%EDTA脫鈣液脫鈣，以大頭針刺入踝關節局部無阻力感為脫鈣完全，HE染色后，于顯微鏡下觀察踝關節組織病理學變化及評分，標準為(1)滑液損傷，無損傷0分，輕度損傷1分，中度損傷或增生2分，嚴重破壞3分；(2)炎性浸潤，無炎癥0分，輕度浸潤1分，溫和的滲透2分，嚴重的滲透3分；(3)軟骨破壞，無損傷0分，輕度破壞1分，中度破壞2分，嚴重破壞伴有軟骨丟失或完全碎裂3分；(4)骨破壞，無損傷0分，輕度軟骨下骨質破壞1分，中度骨質破壞2分，骨破壞嚴重伴有大面積骨丟失3分；(5)骨贅形成，無0分，輕微形成1分，中等形成2分，廣泛形成3分[18]。

2.4.6 Western blot法 給藥4周后，麻醉處死各組大鼠，取下踝關節滑膜組織，用含蛋白酶和磷酸酶抑制劑混合物的高效RIPA組織/細胞裂解液裂解蛋白，加緩沖液，沸水浴5 min變性，上樣，電泳，轉膜1.5 h，5% BSA封閉液封閉1 h，孵育一抗，4 ℃過夜，二抗孵育1 h，掃膜，通過Image J軟件檢測蛋白表達。

3 結果

3.1 足厚度 造模后14 d，與空白組比較，模型組、陽性藥組、八角楓丸劑組大鼠足厚度增大(P<0.01)；造模后21～42 d，與模型組比較，陽性藥組、八角楓丸劑組大鼠足厚度減小(P<0.05，P<0.01)，見表1。

表1 八角楓丸劑對大鼠足厚度的影響

3.2 關節炎指數 造模后14～42 d，與空白組比較，模型組大鼠關節炎指數升高(P<0.01)；造模后21～42 d，與模型組比較，陽性藥組、八角楓丸劑組大鼠關節炎指數降低(P<0.05，P<0.01)，見表2。

表2 八角楓丸劑對大鼠關節炎指數的影響(分，

3.3 臟器指數 與空白組比較，模型組大鼠脾臟、胸腺指數升高(P<0.01)；與模型組比較，陽性藥組、八角楓丸劑組大鼠脾臟、胸腺指數降低(P<0.01)，見表3。

表3 八角楓丸劑對大鼠臟器指數的影響

3.4 血清炎癥因子水平 與空白組比較，模型組大鼠血清TNF-α、IL-1β、TGF-β1水平升高(P<0.01)，IL-10水平降低(P<0.01)；與模型組比較，陽性藥組、八角楓丸劑組大鼠血清TNF-α、IL-1β、TGF-β1水平降低(P<0.05，P<0.01)，IL-10水平升高(P<0.01)，見表4。

表4 八角楓丸劑對大鼠血清TNF-α、IL-10、IL-1β、TGF-β1水平的影響

3.5 踝關節組織病理學 空白組大鼠滑膜組織細胞形態完整，無炎性細胞浸潤，關節軟骨無損傷，關節結構完整；模型組大鼠關節腔內滑膜組織增生，滑膜下組織血管擴張，部分滑膜組織纖維化，有血管翳形成，并伴有大量炎性細胞浸潤；陽性藥物組大鼠病理切片顯示關節面光滑，但細胞形態改變，有纖維化痕跡；八角楓丸劑低劑量組效果不理想，而高劑量組大鼠細胞排列整齊，視野內滑膜細胞增生減少，有少量炎性細胞浸潤，未見血管翳，與模型組比較病理變化明顯，見圖1、表5。

圖1 各組大鼠踝關節組織病理學(×100)

表5 八角楓丸劑對大鼠踝關節組織病理學的影響(分，

3.6 NLRP3、TLR4、IRAK1蛋白表達 與空白組比較，模型組大鼠滑膜組織NLRP3、TLR4、IRAK1蛋白表達升高(P<0.01)；與模型組比較，陽性藥組、八角楓丸劑組NLRP3、TLR4、IRAK1蛋白表達降低(P<0.05，P<0.01)，見圖2、表6。

表6 八角楓丸劑對大鼠滑膜組織NLRP3、TLR4、IRAK1蛋白表達的影響

圖2 各組大鼠滑膜組織NLRP3、TLR4、IRAK1蛋白表達

4 討論

類風濕關節炎(RA)是一種慢性全身性自身免疫性疾病，主要累及關節，引起增殖性滑膜炎。其特點是大量炎性細胞浸潤，形成血管翳，滑膜擴張，侵犯鄰近關節軟骨及軟骨下骨，與腫瘤相似，造成損傷[19-20]。NF-κB信號通路參與各種炎癥因子和基質金屬蛋白酶的產生[21-22]。NF-κB作為一種重要的核轉錄因子在類風濕關節炎的發病機制中發揮關鍵作用，其中包括兩個主要機制，首先NF-κB的激活能增加炎癥介質的轉錄，反過來，這些炎癥介質可以激活NF-κB的表達；兩者都構成正反饋機制，導致類風濕關節炎的炎癥介質[23]。

本研究結果顯示，八角楓丸劑能降低大鼠關節炎指數，能緩解大鼠的足趾紅腫，表明八角楓丸劑能較好的抑制RA大鼠的炎癥癥狀。通過病理學分析可以知道八角楓丸劑組大鼠細胞排列整齊，視野內滑膜細胞增生減少，有少量炎性細胞浸潤，未見血管翳。與模型組比較，病理改變明顯。由此可看出，八角楓丸劑對類風濕關節炎具有良好的治療作用。類風濕關節炎的發病機制較為復雜，根據相關研究顯示，在類風濕關節炎的病變過程中，會使關節積液與滑膜組織中T淋巴細胞和B淋巴細胞數量增多，進而促進多種炎癥因子的分泌，炎癥因子是關鍵功能分子在類風濕性關節炎中影響發病和進展的主要原因之一[24]，包括TNF-α、IL-6和IL-1β[25]。其中IL-1β在類風濕關節炎的發病機制中起著重要的作用。研究表明，IL-1β主要由巨噬細胞產生，IL-1β可以激活單核細胞巨噬細胞，誘導細胞粘附分子，趨化因子和其他炎癥介質，從而導致關節炎癥加劇[26]。本文研究顯示，八角楓丸劑可以降低大鼠血清中IL-1β、TNF-α、TGF-β1水平，升高IL-10水平，提示八角楓丸劑可能通過減少炎癥因子的產生從而減輕類風濕關節炎大鼠足腫脹炎癥反應來發揮抗類風濕關節炎的作用。說明降低炎癥因子的水平可能是八角楓丸劑抗類風濕性關節炎作用機制的一部分。

NF-κB信號通路作為參與炎癥反應的最關鍵的信號通路，其密切作用于慢性疾病的發展過程。NF-κB有能力控制基因產物的表達影響多種細胞反應，包括細胞增殖和細胞凋亡。該信號通路可刺激滑膜的新生血管生成和炎癥反應[27-28]。蛋白免疫印跡法結果顯示，八角楓丸劑能下調NLRP3、TLR4、IRAK1蛋白表達水平，說明八角楓丸劑抗類風濕關節炎的機制與抑制NF-κB信號通路的激活有關。

綜上，八角楓丸劑對牛源性Ⅱ型膠原蛋白所致的類風濕性關節炎具有良好的治療作用，其機制與抑制炎癥因子的產生和下調NF-κB信號通路相關蛋白水平有關。