HPLC法同時測定舒眠膠囊中4種成分

彭 瀟， 雷 艷， 陳思穎， 聶開品， 楊 純， 王愛民， 李勇軍*

(1.貴州醫科大學民族藥與中藥開發應用教育部工程研究中心/省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室，貴州 貴陽 550004；2.貴州醫科大學，貴州省藥物制劑重點實驗室，貴州 貴陽 550004；3.貴州醫科大學藥學院，貴州 貴陽 550004；4.貴州大隆藥業有限責任公司，貴州 貴陽 550004；5.畢節市第一人民醫院，貴州 畢節 551700)

舒眠膠囊為國家基本藥物目錄所收載的中藥復方制劑[1]，由酸棗仁(炒)、柴胡(酒炒)、白芍(炒)、合歡花等8味藥材組成，具有疏肝解郁、寧心安神的療效[2]，主要用于肝郁傷神所致的失眠癥，安全性和臨床療效較好，且應用廣泛[3-5]。方中酸棗仁含有的斯皮諾素等黃酮類物質具有鎮靜催眠及抗抑郁藥理作用[6]，白芍中芍藥苷、芍藥內酯苷等主要成分有抗驚厥等生物學效應，具有明顯的鎮靜、抗抑郁活性[7]，合歡花總黃酮有抗抑郁作用，其中槲皮苷為鎮靜催眠的有效成分[8-9]。舒眠膠囊現行標準收載于《國家藥品標準新藥轉正標準第33冊》，僅對制劑中芍藥苷進行了定量檢測[10]，而含多種有效活性成分的中藥復方制劑是通過多成分、多靶點聯合作用起療效，對其中某單一成分的定量檢測并不足以全面評估制劑的質量的優劣及安全性、有效性與穩定性，多組分評價模式已成為發展趨勢[11]。本實驗采用HPLC法同時測定舒眠膠囊中芍藥內酯苷、芍藥苷、斯皮諾素、槲皮苷的含量，以期為該制劑的質量控制和評價奠定實驗依據。

1 材料

1.1 儀器 UltiMate 3000型高效液相色譜儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)；AE-240型電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；KQ5200E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；超純水機(四川沃特爾科技發展有限公司)。

1.2 試藥 15批舒眠膠囊(每粒裝0.4 g，批號20160721、20160722、20160801、20171201、20171006、20171108、20171002、20170504、20170601、20170910、20170702、20170305、20170404、20170205、20170103)編號S1～S15，均由貴州大隆藥業有限責任公司提供。酸棗仁、柴胡、白芍、合歡花、合歡皮、蟬蛻、僵蠶、燈心草均由貴州大隆藥業有限責任公司提供，經貴州醫科大學劉春花副教授鑒定為正品。芍藥內酯苷、芍藥苷、槲皮苷、斯皮諾素對照品均購于四川省維克奇生物科技有限公司，純度均≥98%，批號分別為wkq18050205、wkq18032104、wkq18041101、wkq18060104。乙腈為色譜純；甲醇、乙醇等試劑均為分析純；水為自制超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Waters CORTECS C18色譜柱(4.6 mm×150 mm，2.7 μm)；流動相乙腈(A)-水(含0.1%磷酸)(B)，梯度洗脫(0～20 min，10%～15%A；20～30 min，15%～16%A；30～40 min，16%～18%A；40～42 min，18%～95%A)；體積流量1 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長242 nm；進樣量10 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取上述4種對照品適量，加甲醇分別制成每1 mL含芍藥內酯苷2.362 mg、芍藥苷2.560 mg、斯皮諾素0.945 mg、槲皮苷2.040 mg的貯備液，精密量取適量，置于5 mL量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL分別含四者0.755 8、0.819 2、0.075 6、0.204 0 mg的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液 精密稱取膠囊內容物1 g，置于磨口具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，稱定質量，超聲(200 W、40 kHz)處理30 min，取出，放冷，50%甲醇補足減失的質量，搖勻，取上清液，0.2 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 按照處方比例及制劑工藝，分別制成缺酸棗仁(炒)、缺白芍(炒)、缺合歡花的陰性樣品，按“2.2.2”項下方法制備，即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 專屬性考察 取“2.2”項下各溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，發現陰性無干擾，各成分分離度良好(R>1.5)，表明該方法專屬性良好，見圖1。

1.芍藥內酯苷 2.芍藥苷 3.斯皮諾素 4.槲皮苷

2.3.2 線性關系考察 精密吸取“2.2.1”項下對照品溶液適量，甲醇制成不同質量濃度，在“2.1”項色譜條件下進樣測定。以對照品質量濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)進行回歸，結果見表1，可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

表1 各成分線性關系

2.3.3 精密度試驗 精密稱取膠囊(S3)內容物1 g，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件進樣測定6次，測得芍藥內酯苷、芍藥苷、斯皮諾素、槲皮苷峰面積RSD分別為2.0%、1.0%、0.62%、0.68%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 重復性試驗 精密稱取膠囊(S3)內容物1 g，按“2.2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.1”項色譜條件進樣測定，測得芍藥內酯苷、芍藥苷、斯皮諾素、槲皮苷含量RSD分別為1.8%、1.6%、1.4%、1.7%，表明該方法重復性良好。

2.3.5 穩定性試驗 精密稱取膠囊(S3)內容物1 g，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，室溫下于0、2、4、6、8、12、24 h在“2.1”項色譜條件下進樣測定，測得芍藥內酯苷、芍藥苷、斯皮諾素、槲皮苷峰面積RSD分別為0.39%、0.49%、1.5%、0.85%，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗 精密稱取4種成分含量已知的膠囊(S3)內容物6份，每份0.5 g，精密加入各對照品適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，計算回收率，結果見表2。

表2 各成分加樣回收率試驗結果(n=6)

2.3.7 樣品含量測定 取15批膠囊，每批2份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，計算含量，結果見表3。

表3 各成分含量測定結果(n=2)

3 討論

3.1 供試品溶液制備方法篩選 本實驗首先考察了回流、超聲提取，再考察了提取溶劑甲醇、75%甲醇、50%甲醇、25%甲醇、乙醇、75%乙醇、50%乙醇、25%乙醇、水，最后考察了提取時間30、60、90、120 min，最終確定采用50%甲醇超聲提取30 min作為供試品溶液制備方法，此時指標成分提取率較高，峰形對稱性較好。

3.2 色譜條件篩選 本實驗首先考察了艾杰爾Venusil XBP(L) C18、沃特世 Waters CORTECS C18色譜柱，然后考察了流動相甲醇-水、甲醇-水(含0.1%磷酸)、乙腈-水(含0.1%磷酸)、乙腈-水(含0.1%甲酸)對色譜峰的影響，綜合考慮指標成分分離度與峰形，結合基線平穩狀況，最終確定采用Waters CORTECS C18色譜柱，并以乙腈-水(含0.1%磷酸)進行梯度洗脫。同時參考文獻[12-13]結合二極管陣列檢測器DAD全波長掃描，發現芍藥內酯苷、芍藥苷在230 nm左右均有最大吸收，而且大于260 nm后兩者吸收均較弱；斯皮諾素、槲皮苷分別在260、345 nm左右有較大吸收，綜合考慮峰高，最終選用242 nm作為檢測波長，此時各成分峰形、分離度良好，陰性樣品無干擾，專屬性良好。

3.3 指標成分篩選 本實驗選擇芍藥內酯苷、芍藥苷、斯皮諾素、槲皮苷作為指標成分，均是發揮抗抑郁、鎮靜催眠的主要活性物質[14-16]，這與舒眠膠囊用于治療肝郁傷神所致失眠癥相符。現代藥理研究表明，酸棗仁中以酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B為代表的皂苷類物質也為其鎮靜安神的主要藥效成分；柴胡中柴胡皂苷A、柴胡皂苷D等也具有抗抑郁、鎮靜鎮痛藥理活性[17-18]，但該類成分在紫外檢測器上存在末端吸收，基線易漂移，受干擾較嚴重，故今后將采用蒸發光散射檢測器對其進行研究。

4 結論

本實驗建立HPLC法同時測定舒眠膠囊中芍藥內酯苷、芍藥苷、斯皮諾素、槲皮苷的含量，該方法簡便準確，具有良好的精密度、重復性、穩定性，可為該制劑質量標準的完善和提高奠定實驗依據。