左旋紫草素對ConA誘導小鼠免疫性肝損傷的保護作用

努力比亞·阿不都克尤木， 胡利萍， 秦冬梅， 魯曉擘*

(1.新疆醫科大學第一附屬醫院感染科，新疆 烏魯木齊 830000；2.石河子大學藥學院，新疆 石河子 832002)

免疫性肝損傷(immunological liver injury，ILI)是一種較為常見的自身免疫性疾病，主要表現為肝臟組織內出現大量的炎癥細胞浸潤，同時轉氨酶、炎癥因子水平大幅度升高等[5]，是肝纖維化、肝硬化以及肝臟腫瘤等發生的重要因素，也是肝臟疾病發展的重要過程。近年來，國內外對紫草的研究表明，紫草素具有良好的抗炎、抑菌、抗腫瘤和增強免疫功能等多種功效[6]。魯明霞等[7]研究表明紫草素可下調四氯化碳誘導的肝纖維化大鼠肝組織中TGF-β1的表達，從而抑制大鼠肝纖維化的發生。但是紫草素毒性較強，而其藥理作用又不具特異性，因而在臨床上未能推廣應用。左旋紫草素與紫草素互為旋光異構體，其在藥理作用方面有著許多相似之處，但是左旋紫草素的保肝作用研究卻相對較少，藥理毒性也知之甚少，因此本研究利用刀豆蛋白A (concanavalin A，ConA)誘導小鼠模擬免疫性肝損傷模型，研究左旋紫草素對小鼠免疫性肝損傷的保護作用，為紫草的藥用價值開發提供理論依據。

1 材料

1.1 儀器 5426XG離心機、Galaxy-170S型CO2恒溫培養箱(德國Eppendorf公司)；3001全波長掃描多功能讀數儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)；BP211D分析天平(德國Sartorius公司)；電熱水浴鍋(北京市永光明醫療儀器有限公司)；BCD-272AY容聲冰箱(廣東海信家電集團股份有限公司)；SW-CJ-2FD超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術有限公司)。

1.2 藥物、細胞與試劑 左旋紫草素(含量≥98%，批號200506)購自中國食品藥品檢定研究院。甘草酸二銨膠囊(批號180327302)購自江蘇正大天晴藥業集團股份有限公司。小鼠巨噬細胞株(RAW264.7)由新疆醫科大學保存。DMEM培養基(批號8118344)、胎牛血清(批號1828728)均購自賽默飛世爾(蘇州)儀器有限公司；青鏈霉素(批號SV30010)、胰酶(批號SH3004201)均購自美國HyClone公司；DMSO(批號D8371)購自北京索萊寶科技有限公司；刀豆蛋白A(ConA)(批號C2272)購自美國Sigma公司；MDA(批號20170105)、T-SOD(批號20170105)、AST(批號20170112)、ALT(批號20170112)、AKP(批號20170115)、GST(批號20161211)、考馬斯亮藍(批號20160112)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；小鼠白介素1β(IL-1β，批號20170117)、小鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α，批號20161205)、小鼠γ干擾素(IFN-γ，批號20170115)試劑盒均購自上海雅吉生物科技有限公司。

1.3 動物 昆明種小鼠60只，雌雄各半，體質量(20±2) g，購自新疆維吾爾自治區疾病預防控制中心，實驗動物生產許可證號SCXK(新)2016-0001，自由飲水，適應飼養2 d準備實驗。

2 方法

2.1 細胞培養 RAW 264.7細胞加到含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM 培養基中，在37 ℃、5% CO2下常規培養，每2～3 d傳代1次。

2.2 MTT法檢測左旋紫草素對RAW 264.7細胞的毒性 將細胞以每孔1×105個密度接種在96孔板中孵育過夜，加入含不同濃度左旋紫草素的培養基溶液處理24 h，小心吸去培養液，加入含10% MTT溶液的新鮮培養基繼續培養4 h，吸去上清，每孔加入110 μL Formazan 溶解液，置搖床上低速振蕩10 min，酶標儀在490 nm 波長處測量各孔光密度(OD)值，計算細胞存活率，公式為細胞存活率=(OD1/OD0)×100%(OD1為各處理組，OD0為正常培養細胞)。

2.3 左旋紫草素對LPS誘導RAW 264.7細胞產生NO的影響 將細胞以每孔1×105個密度接種在96孔板中孵育過夜，用合適濃度的左旋紫草素預處理30 min，每孔加入LPS(1 μg/mL)繼續培養24 h，取100 μL細胞培養上清液，與等體積Griess試劑混合，5 min內使用酶標儀在550 nm波長處測量每孔OD值[8]。

2.4 分組及給藥 將小鼠隨機分為正常組，模型組，陽性藥組(100 mg/kg甘草酸二銨膠囊)，左旋紫草素低、中、高劑量組(0.4、0.8、1.6 mg/kg)，每組10只，雌雄各半，正常組、模型組小鼠每天同一時間灌胃生理鹽水0.5 mL/只，陽性藥組、左旋紫草素高、中、低劑量組每天灌胃相應藥物1次，連續7 d。最后1次給藥后1 h，除正常組外其余各組小鼠尾靜脈注射ConA(18 mg/kg)形成急性免疫性肝損傷模型，正常組小鼠注射等量生理鹽水，禁食不禁水，8 h后處死取材，并檢測各項指標。

環境承載力(ELR)是指經濟投入能值加上不可更新資源能值(F+T+N)與可更新環境資源能值(R)的比率，該數值不僅可以反映生態經濟系統運轉對環境系統的壓力，而且可以反映其農業生產對自然資源的充分利用程度。2010年河南省環境承載力為4.44，低于發達國家平均水平，說明河南省的農業生產對環境壓力的較小，且具有較大的發展潛力。

2.5 取材 造模結束后8 h，稱定小鼠體質量，眼眶取血，3 000 r/min離心10 min分離血清，在4 ℃下保存，用于檢測肝臟指標[9]。再將小鼠頸椎脫臼處死，取部分肝臟組織，10%福爾馬林固定以制備病理切片，再取肝臟右葉相同部位小塊組織約0.5 g，4 ℃冷生理鹽水沖洗浮血，加10倍量冰冷生理鹽水研磨勻漿，置于冷凍離心機中，4 ℃、3 000 r/min離心10 min，取上清液，在4 ℃下保存[10]。

2.6 指標檢測

2.6.1 肝臟、脾臟指數 將小鼠肝臟、脾臟置于生理鹽水中清洗，濾紙吸干血水后置于稱量紙上，電子天平稱定質量，計算肝臟、脾臟指數[11]，公式分別為肝臟指數=(肝臟質量/小鼠體質量)×100%、脾臟指數=(脾臟質量/小鼠體質量)×100%。

2.6.2 血清和肝臟組織勻漿炎癥因子、轉氨酶水平 將小鼠肝臟組織勻漿，檢測蛋白濃度，采用硫代巴比妥酸比色法檢測丙二醛(MDA)水平，黃嘌呤氧化酶法檢測總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性，血清AST、ALT、AKP、GST水平檢測嚴格按說明書進行，ELISA法檢測肝臟組織勻漿IFN-γ、TNF-α、IL-1β水平。

2.6.3 肝臟組織病理學 處死小鼠后取肝臟組織，置于福爾馬林中固定48 h，石蠟包埋切片，用HE、VG染色，在光學顯微鏡下進行組織病理學觀察。

3 結果

3.1 左旋紫草素對RAW 264.7細胞存活率、NO水平的影響 如圖1所示，左旋紫草素濃度小于200 μmol/L時細胞存活率大于90%，而在250、300、400 μmol/L時均表現出細胞毒性，細胞存活率分別為54.8%、31.6%、25.0%，故本實驗采用50、100、200 μmol/L左旋紫草素進行研究。與對照組(0 μmol/L左旋紫草素，1 μg/mL LPS)比較，100、200 μmol/L左旋紫草素均能降低由LPS刺激產生的NO水平(P<0.01)。

注：與對照組(0 μmol/L左旋紫草素，1 μg/mL LPS)比較，**P<0.01。

3.2 左旋紫草素對小鼠肝臟、脾臟指數的影響 如表1所示，與正常組比較，模型組小鼠肝臟、脾臟系數均升高(P<0.01)；與模型組比較，陽性藥組、左旋紫草素高劑量組小鼠肝臟、脾臟指數均下降(P<0.05，P<0.01)，而中、低劑量組兩者無明顯變化(P>0.05)。

表1 左旋紫草素對小鼠肝臟、脾臟指數的影響

3.3 左旋紫草素對小鼠血清轉氨酶水平的影響 如圖2所示，與正常組比較，模型組小鼠血清AST、ALT、GST、AKP水平均升高(P<0.05，P<0.01)；與模型組比較，陽性藥組、左旋紫草素高劑量組均能降低AST、ALT、GST、AKP水平(P<0.05，P<0.01)，中劑量組僅能降低AST水平(P<0.05)，低劑量組AST、ALT、GST、AKP水平無明顯變化(P>0.05)。

注：與正常組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01；與模型組比較，*P<0.05,**P<0.01。

3.4 左旋紫草素對小鼠肝臟組織勻漿T-SOD活性及MDA、白蛋白水平的影響 如圖3所示，與正常組比較，模型組小鼠T-SOD活性、白蛋白水平降低(P<0.05，P<0.01)，MDA水平升高(P<0.05)；與模型組比較，陽性藥組、左旋紫草素高劑量組均能增加T-SOD活性(P<0.05)，降低MDA水平(P<0.05)，升高白蛋白水平(P<0.01)，而中、低劑量組無明顯變化(P>0.05)。

注：與正常組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01；與模型組比較，*P<0.05,**P<0.01。

3.5 左旋紫草素對小鼠血清IFN-γ、TNF-α、IL-1β水平的影響 如圖4所示，與正常組比較，模型組小鼠血清TNF-α、IL-1β、IFN-γ水平均升高(P<0.05)；與模型組比較，陽性藥組能降低TNF-α、IL-1β、IFN-γ水平(P<0.05)，左旋紫草素高劑量組能降低IFN-γ水平(P<0.05)，各劑量組均能降低TNF-α水平(P<0.01)，雖然有降低IL-1β水平的趨勢，但均無統計學意義(P>0.05)。

注：與正常組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01；與模型組比較，*P<0.05,**P<0.01。

3.6 左旋紫草素對免疫性肝損傷小鼠肝臟病理的影響 圖5～6顯示，正常組小鼠肝臟結構清晰，肝索分布規律，肝細胞形態正常無變性且排列有序，炎癥細胞浸潤較少[12]；模型組小鼠肝組織結構出現破壞，形成纖維縱隔和假小葉，肝索排列紊亂，很多肝細胞變性，呈現腫脹壞死，邊界模糊，肝細胞胞漿發生紅染；與模型組比較，陽性藥組小鼠肝臟組織有所改善，肝細胞排列比較規則，肝細胞間隔變窄，肝細胞的胞質均勻，炎性浸潤程度減輕；左旋紫草素各劑量組均可不同程度減輕小鼠肝組織病變，以高劑量組最明顯，肝小葉可見，炎性浸潤減輕，肝細胞形態較為正常，肝細胞索排列較為有序。

圖5 各組小鼠肝組織病理組織學變化(HE，×200)

圖6 各組小鼠肝組織病理組織學變化(VG，×400)

4 討論

機體免疫應答反應介導的肝損傷是許多肝臟疾病發生發展的重要原因之一，研究表明自由基、酶以及脂質過氧化等均可引起肝臟免疫反應，導致肝細胞壞死[13]。 ConA誘導的小鼠急性免疫性肝損傷是近年來較為理想的免疫性肝損傷模型，具有操作簡單、易重復、模型成功率高等優點，經常作為研究保肝藥物的模型[14]。本實驗采用尾靜脈注射ConA的方法建立小鼠免疫性肝損傷模型，實驗中模型組AST、ALT水平等均升高，病理組織學顯示肝細胞嚴重壞死，證明肝功能損傷嚴重，造模成功。

現代研究發現，紫草具有抗炎、抗病毒、抗菌、抗腫瘤等作用[15-16]。其富含的萘醌類化合物具有較好的保肝降酶作用，有望成為治療肝炎的有效藥物[17]。本實驗首先利用RAW264.7巨噬細胞進行左旋紫草素體外抗炎活性初篩。炎癥是伴隨肝臟疾病的一種常見病理反應，RAW264.7細胞是主要的炎性細胞，也是免疫反應的效應細胞，在機體免疫系統中起著重要的作用。研究發現，體內過量的NO會促進炎癥性疾病的發生和發展[18]，因此，抑制NO的釋放可能是緩解炎癥反應的重要途徑[19-20]。本實驗中左旋紫草素可以降低由LPS刺激RAW264.7細胞產生的NO相對水平，初步說明左旋紫草素體外具有一定的抗炎活性。

體內采用ConA誘導建立的小鼠免疫性肝損傷模型，與模型組比較，左旋紫草素能改善小鼠肝臟轉氨酶水平，同時升高T-SOD活性，降低MDA水平(P<0.05)。MDA 是機體發生脂質過氧化反應的最終代謝產物，其水平可以反映細胞或組織受氧化損傷的嚴重程度，SOD具有消除單線態氧的作用，是體內抗氧化防御系統的第一道防線，可以阻斷脂質過氧化反應的發生[21-22]，該結果表明左旋紫草素的保肝作用與其抗氧化作用相關。進一步研究發現，左旋紫草素能降低小鼠血清IFN-γ(P<0.05)、TNF-α(P<0.01)的水平。TNF-α主要由單核巨噬細胞分泌，它在血清的濃度與機體的炎癥嚴重程度呈正相關，是檢測炎癥細胞的關鍵指標[23]。炎性因子的過度表達也是造成肝損傷的原因之一，有報道稱抑制TNF-α的生成，在減輕肝損傷，緩解肝纖維化中具有重要意義[24]，因此進一步證明左旋紫草素在體內也具有抗炎活性，并且與體外實驗結果相結合表明左旋紫草素的保肝作用與其抗炎作用相關。

綜上所述，左旋紫草素在無細胞毒性的情況下能通過降低轉氨酶水平、減少炎癥因子的釋放等作用保護由ConA引起的小鼠免疫性肝損傷。