短期干旱脅迫對桔梗生理生態及其皂苷含量的影響

李 敏， 張 萌， 王士杰， 程 林， 韓 梅*， 楊利民*

(1.吉林農業大學中藥材學院，吉林 長春 130118；2.吉林農業科技學院中藥學院，吉林 吉林 132101)

桔梗Platycodongrandiflorus(Jacq.) A.DC.是一種傳統的中草藥。桔梗主要種植在我國安徽、河北、河南、四川、江蘇和內蒙古等干旱半干旱地區[1]。桔梗作為保健食品和中藥，用于治療咳嗽、痰多、喉痛等病癥[2]。三萜皂苷廣泛存在于中草藥中，以游離形式存在或以糖苷或酯結合糖的形式存在。藥理學研究證明，桔梗皂苷為其主要的有效成分，具有抗腫瘤、降血糖、抗肥胖等多種藥理活性[3]，其中桔梗皂苷D(platycodin D，PD)與去芹糖桔梗皂苷D(deapio-platycodin D，DPD)為桔梗中的主要活性成分，具有抑制胰脂肪酶和抗腫瘤活性[4-5]。

植物次生代謝產物決定了藥材的質量，而植物次生代謝產物本身也受到脅迫條件的影響，尤其是干旱對藥物質量的影響較大[6]。在栽培過程中，可以通過干旱脅迫等多種途徑增加藥用植物的次生代謝產物[7]。適度的干旱脅迫有利于桔梗幼苗總皂苷的積累[8]。到目前為止，桔梗適應干旱的生理機制尚未全面闡明，為了探究桔梗在短期干旱脅迫下的生理反應，如光合作用、葉綠素熒光參數、抗性酶系統及桔梗皂苷積累等情況，本實驗對2年生桔梗進行系統研究，以期為提高桔梗品質，實現桔梗的生態種植提供指導。

1 材料

1.1 藥材 實驗地點選在吉林省長春市吉林農業大學藥用植物栽培育種及生理生態調控實踐教學基地。成熟的桔梗種子采自吉林農業大學試驗田，經吉林農業大學中藥材學院楊利民教授鑒定為桔梗Platycodongrandiflorus(Jacq.) A.DC. 種子。選擇大小一致、飽滿、無病蟲害的種子，種植在同一規格花盆中(上口徑32 cm，下口徑28 cm，深度25 cm)。每盆裝5 kg混有有機肥的土壤。試驗土壤為疏松的砂壤土，透氣排水性能良好，有機質18.42 g/kg、堿氮108.15 mg/kg、速效磷39.86 mg/kg、速效鉀98.65 mg/kg。定株，定期進行管理，包括除草、除蟲、澆水等。

1.2 試劑及儀器 PRO測定試劑盒、MDA測定試劑盒、SOD酶活性測定試劑盒、POD酶活性測定試劑盒、CAT酶活性測定試劑盒、可溶性糖測試劑盒、可溶性蛋白測定試劑盒購于南京建成生物工程研究所。桔梗皂苷對照品購于上海源葉生物科技有限公司。甲醇、乙腈(色譜純，美國Fisher Scientific公司)；水為雙重蒸餾水；其他試劑為國產分析純。MDF-382E超低溫冰箱(日本SANYO公司)；高速離心機(美國Thermo公司)；SpectraMax 190酶標儀(美國Molecular Devices公司)；Agilent1260型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；LCpro+便攜式光合儀(英國 ADCBioScientific Ltd.公司)；調制葉綠素熒光儀(英國 Hansatech公司)。

2 方法

2.1 短期干旱脅迫試驗 在短期干旱脅迫試驗前的半個月，每個花盆每2 d灌溉1次，以保證水分條件一致。2018年9月5日，開展干旱脅迫試驗。將60盆生長良好、一致性好、無病蟲害的桔梗植株隨機分為干旱組和對照組，每組30盆。干旱組的土壤在試驗開始前(2018年9月4日)一次性灌溉至飽和，土壤含水量約為33.7%。而后干旱組在連續干旱處理中不再澆水，直到桔梗的葉子枯萎。對照組根據長春地區近10年的9月份平均降雨量，每2 d澆一次水，澆水量為800 cm3，土壤含水量控制在16% ～18%，以保證桔梗的正常生長發育。在12 d，桔梗的葉子開始枯萎，下午6點再向干旱組供水。此后干旱組與對照組的管理相同，直至2018年10月30日秋季(HT)統一收獲。

在干旱脅迫實驗中，分別在第3、6、9、12、15、18天以及秋季進行了取樣。每次取樣時隨機選擇3盆，去泥沙、清洗、瀝干水分后，取部分桔梗根組織，貯存于-80 ℃超低溫冷藏箱，用于后續試驗。剩余部分桔梗根置于烘箱中，65 ℃烘干至恒定質量，用高速萬能打粉機磨成細粉，過60目篩，用于桔梗皂苷的測定。

2.2 桔梗皂苷含量測定 稱取桔梗根粉末200 mg，80%甲醇在60 ℃下超聲提取3次，每次20 min，蒸發溶劑，將殘渣用80%甲醇溶解稀釋至10.0 mL量瓶中，0.45 μm微孔濾膜過濾，取上清液。

分析采用Promasil C18色譜柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)；流動相乙腈 (A)-0.2% 甲酸(B)，梯度洗脫(0～15 min，20%A；15～60 min，22%A；60～65 min，30%A；65～70 min, 20% A，最后用20%A運行5 min)；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量10 μL。漂移管溫度75 ℃；載氣(N2)體積流量2.5 L/min。制備含桔梗皂苷D(PD)、去芹糖-桔梗皂苷D(DPD)和桔梗皂苷D3(DP3)的甲醇溶液母液，稀釋至適當濃度，以對照品質量濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)進行回歸，得PD、DPD、PD3的回歸方程分別為logY=0.611 5logX-3.324 6(r=0.999 9)、logY=0.6004logX-3.341 1(r=0.999 9)、logY=0.596 9logX-3.269 1 (r=0.999 8)。色譜圖見圖1。

1.桔梗皂苷D3 2.去芹糖-桔梗皂苷D 3.桔梗皂苷 D

2.3 光合作用及葉綠素熒光參數測定 在桔梗短期干旱脅迫期間，每個處理隨機選取長勢相似的植株15株，掛牌，于2018年9月4日開始，每隔3 d，上午 8：30～11：30 采用Li-6400便攜式光合儀對桔梗葉片進行光合參數測定，同時采用PAM-2100便攜式葉綠素熒光儀測定桔梗葉片葉綠素熒光參數進行測定。

2.4 生理生化指標測定 PRO、MDA、SOD、POD、CAT、可溶性糖(SS)、可溶性蛋白(SP)含量測定均按照試劑盒操作規程進行操作，并計算各指標水平。

2.5 數據分析 采用Excel 2013對原始數據進行整理，SPSS 22.0、GraphPad Prism 7.0、OriginPro進行分析和作圖。

3 結果

3.1 土壤水分變化 土壤含水量變化見圖 2，可知在短期水分脅迫開始后，處理組土壤含水量由處理開始時的 33.5%，不斷下降到12 d后的8.5%，13 d開始進行復水處理，使處理組土壤水分恢復到與對照組相同水平(16%～18%)。

圖2 短期干旱脅迫下土壤水分含量變化

3.2 短期干旱脅迫對桔梗光合指標參數影響 短期干旱脅迫對桔梗葉片光合特性的影響見圖3，可知隨著土壤含水量的降低，桔梗的WUE和Pn均呈下降趨勢，Ls和Ci在干旱初期增加，后期逐漸下降；處理組Pn、WUE和Ci均低于對照組，處理組Ls在干旱初期高于對照組(P<0.01)；復水后，桔梗的WUE、Ci和Ls得到了恢復，短期內觀察發現，處理組與對照組無統計學差異(P>0.05)。

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.3 短期干旱脅迫對桔梗葉綠素熒光參數的影響 桔梗葉片的葉綠素熒光參數受到短期干旱脅迫的影響見圖4，可知隨著干旱程度加重，桔梗葉片Fv/Fm和φPSⅡ逐漸降低，并在干旱的12 d分別降到最低0.733和0.31(P<0.01)，提示桔梗在受到干旱影響后光能的利用力減弱；在干旱處理下桔梗的NPQ亦也受到影響，在開始干旱的6 d，NPQ升高(P<0.05)，之后逐漸下降，復水后仍未能達到對照組的正常水平，而qP受干旱影響不明顯。

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.4 短期干旱脅迫對桔梗根保護酶活性的影響 短期干旱處理對桔梗根部保護酶活性的影響結果見圖5，可知在短期干旱處理過程中，對3種保護酶SOD、POD、CAT活性均有影響，其中在整個實驗階段，處理組SOD與POD活性變化趨勢與對照組基本一致；在開始干旱的3、6 d，SOD活性低于對照組(P<0.05，P<0.01)，隨著干旱程度的增加，處理組SOD活性不斷提高，并在9、12 d活性高于對照組(P<0.05)，復水后出現降低，但仍高于對照組；POD除了3、18 d外，在整個實驗過程總，處理組均高于對照組(P<0.05)；CAT活性受干旱影響較大，在干旱3 d時，處理組低于對照組(P<0.01)，然后隨著干旱的加重，處理組急劇增加并高于對照組，復水后雖然略有下降，但仍高于對照組。

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.5 短期干旱脅迫對桔梗根滲透調節物質的影響 短期干旱對桔梗根部滲透調節物質和丙二醛水平的影響結果見圖6，可知在實驗過程中，處理組與對照組的SP和PRO水平變化趨勢基本一致，SP呈現逐漸升高后下降的趨勢，且隨著干旱程度增加，處理組在干旱最嚴重的12 d達到最大值為 7.636 mg/g(P<0.05)，在復水后SP水平有所下降但仍高于對照組(P<0.05)，PRO整個實驗過程中，處理組均高于對照組，桔梗根部PRO水平在干旱的3 d增加，在6、9 d下降，在干旱最嚴重的12 d又開始增加，并且復水后仍在上升；SS水平受干旱影響不明顯，僅在干旱比較嚴重的9 d和12 d高于對照組(P<0.05)，復水后2組間無顯著差異；MDA在開始干旱的3 d出現短暫的水平降低，隨后在干旱程度的加深過程中不斷累積，12 d達到最大值 25.289 nmol/g，在復水后MDA水平有所下降。

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.6 短期干旱脅迫對桔梗皂苷含量變化的影響 短期干旱對桔梗皂苷含量的影響見圖7，可知桔梗皂苷含量可以反映出植物對水分變化的響應程度，也是評價桔梗質量的標準。結果表明，隨著土壤含水量的減少PD及DPD含量總體呈增長趨勢；在處理組中，PD及DPD總體趨勢相似，在9、12 d 重度干旱階段，其含量均增加，PD分別達到了130.526、119.542 μg/g，DPD分別達到了45.209、 45.45 μg/g，均高于對照組；在干旱脅迫實驗過程中，兩組間PD3的含量變化并不明顯，但在秋季HT時對照組高于處理組(P<0.01)；PD、DPD含量在秋季HT時均高于對照組，說明干旱脅迫有利于桔梗主要皂苷類成分的積累。

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.7 短期干旱脅迫下桔梗各指標的相關分析及主成分分析 利用SPSS 22.0對短期干旱脅迫下桔梗皂苷與各生理指標的相關性進行分析，結果見表1，可知光合參數中僅Pn與PD極顯著負相關(P<0.01)，Ls 與 DPD 為極顯著負相關(P<0.01)；葉綠素熒光參數中，Fv/Fm與PD3有顯著的負相關(P<0.05)，而φPSⅡ與 PD、DPD均為極顯著負相關(P<0.01)，可能因為光合作用參數及葉綠素熒光參數并未直接參與于桔梗根部皂苷的合成而起間接作用，故對 PD、PD3 及DPD 的生物合成影響較弱。植物保護酶和滲透調節物質中 SOD、SP、MDA 對 PD及 DPD 的合成有顯著的促進作用(P<0.05)，而其他生理指標與桔梗皂苷的相關性并未達到顯著水平。

表1 短期干旱脅迫下桔梗皂苷與各生理指標的相關性分析

為了探討短期干旱對桔梗3種皂苷(PD、DPD、PD3)、光合作用(Pn、WUE、Ci、Ls)、葉綠素熒光參數(Fv/Fm、 φPSII、qP、NPQ)、滲透調節物質(SP、PRO、SS)、MDA、保護酶(SOD、POD、CAT)共18個指標間的交互影響，基于主成分析構建各指標的雙標圖，雙標圖中的向量表示了指標的信息，2個指標間夾角的余弦的絕對值表示它們之間相關性的大小[9]，其值越大表明2個向量對應的指標之間相關性越高，當2個向量近似垂直時，指標之間相關性很弱，幾乎互不影響[10]。

對短期干旱脅迫下桔梗各指標進行主成分析并繪制雙標圖，結果見圖8。根據18個主成分所保留原始變量信息的大小，提取2個主成分，其中PC1(第一主成分)和 PC2(第二主成分)差異顯著，對原始資料的解釋率分別為35.40%、21.87%，共計57.27%。圖8、表2 顯示，PC1與桔梗皂苷(PD、DPD、PD3)、WUE、Ci、qP、NPQ、3種保護酶(SOD、POD、CAT)、MDA 及 SP 正相關，且Ci、SOD、CAT、SP、MDA、PD、DPD的變量系數較大，為正向主導變量，而Ls、Fv/Fm 和φPSⅡ為負向主導變量；PC2中，WUE、POD和 PRO 的變量系數為較大且為正，為正向主導變量，負向變量系數Ls、SOD、SS、MDA、PD、DPD 中僅SS和PD變量絕對值較大，為負向主導變量。PC1 和 PC2 中這些主導變量可以反映18個變量的綜合指標。

圖8 短期干旱脅迫下桔梗各指標的主成分分析圖

表2 旋轉后因子載荷

4 討論與結論

在干旱脅迫發生后，植物會通過自身一系列理態學程和機理去防御和適應脅迫。干旱處理對桔梗的光合特性及葉綠素熒光參數有一定的影響。處理組Pn、WUE和Ci均低于對照組，處理組Ls 在干旱初期高于對照組(P<0.05)。復水后的短期觀察發現，處理組與對照組桔梗Pn、WUE、Ci 和Ls無統計學差異(P>0.05)。Fv/Fm、φPSⅡ受到短期持續干旱的顯著影響，隨著干旱程度加重桔梗葉片Fv/Fm和φPSⅡ逐漸降低，并在干旱的12 d分別降到最低0.733和0.31(P<0.01)，提示桔梗在受到干旱影響后光能的利用力減弱。

PRO、SP、SS 等作為滲透保護劑，在脅迫條件下植物的適應過程中發揮著關鍵作用[11]。本實驗發現，處理組SP 干旱最嚴重的12 d達到最大值為7.636 mg/g(P<0.05)，復水后有所下降但仍高于對照組(P<0.05)。PRO 整個實驗過程中，處理組均高于對照組。MDA在干旱脅迫條件下，其水平隨膜脂過氧化程度的增加而增加[12]。在桔梗短期干旱脅迫中，MDA水平在3 d出現短暫降低，隨著干旱程度加深不斷累積，12 d達到最大值 25.289 nmol/g。

干旱脅迫前期不同處理防風SOD、POD、CAT 活性均呈增加趨勢[7]，當植物受到脅迫后，植物的細胞和亞細胞系統通過 SOD、POX、CAT 等抗氧化酶來抵御活性氧自由基的細胞毒作用[13]；隨干旱程度增加，處理組SOD活性不斷提高，并在9、12 d 活性高于對照組(P<0.05)，復水后出現降低，但仍高于對照組；除了3、18 d 外，處理組POD均高于對照組；CAT隨干旱加重，處理組急劇增加并高于對照組，復水后仍高于對照組。以上結果說明，桔梗根部組織通過增加 SOD、POD、CAT 等抗氧酶活性來抵御干旱脅迫帶來的傷害。

適度的干旱脅迫有利于藥用植物次生代謝產物積累[14-16]，在受不同非生物脅迫的法國南部的大葉菊植物中觀察到大量倍半萜[17]。本研究發現，隨著土壤水分含量的減少，PD及DPD含量總體呈增長趨勢，在 9、12 d 重度干旱階段其含量均高于對照組，動態變化可認為是對抗干旱脅迫的防御機制。

綜上所述，本研究可為考察短期干旱脅迫對桔梗活性成分積累的影響提供依據，也能為進一步探討該藥材對干旱脅迫的響應機制提供參考。