DNA鑷子型電致化學發光生物傳感器高靈敏檢測MicroRNA-21

馮 程，張茂美

(常德職業技術學院，湖南 常德 415000)

MicroRNA是一類內源性、非編碼的單鏈短RNA分子，能在翻譯和轉錄過程中調控基因表達[1-2]。他們在許多生物過程中扮演重要角色，如細胞分化、凋亡、增殖、移動、入侵、疾病的產生和癌癥的形成等過程[3-4]。microRNA-21正調控于乳腺癌基因。因此，microRNA可作為人類癌癥的生物標記物用于癌癥的早期診斷[5]。目前，對于microRNA檢測傳統方法有Northern blot、實時熒光定量PCR(Real-time PCR)和DNA微陣列芯片檢測。

電致化學發光(ECL)microRNA生物傳感器是將核酸分子堿基互補配對技術和電化學分析方法結合而發展起來的一種靈敏度高、選擇性好、響應快速、操作簡單的新型生物傳感器。為了對microRNA進行高靈敏檢測以達到對癌癥的早期診斷，新型納米材料、DNA分子機器被廣泛應用于microRNA傳感器的構建中，有望成為腫瘤早期診斷的新型分子標志并應用于實際臨床研究。

1 實 驗

1.1 儀器和試劑

MPI-A型毛細管電泳電化學發光檢測儀；CHI610A型電化學工作站；電子天平；超聲清洗機；高速臺式冷凍離心機；移液槍；三電極體系：玻碳電極(GCE，Φ=4 mm)及其修飾電極為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉑絲為對電極；JBZ-12H 磁力攪拌器； ETC PCR儀， PHS-3C/pH計。

DNA Primer(A、B、C、H1、H2、H3)購于賽默飛世爾科技中國有限公司；microRNA-21購于大連寶生物有限公司；

1.2 實驗方法

1.2.1 再生型生物傳感器的制備過程

將玻碳電極(GCE，Φ=4 mm)于麂皮上經0.3 μm和0.05 μm的三氧化二鋁粉末拋光使成鏡面，并用超純水清洗干凈，再依次用超純水、乙醇、超純水超聲洗滌約5分鐘/次，清洗后的電極置于室溫下晾干，備用。然后，將電極在-0.2 V恒電位下置于2 mL HAuCl4(1%)溶液中沉積30 s，形成一層致密納米金層，以固載組裝完成的DNA鑷子。最后滴加15 μL microRNA-21混合溶液，反應1～2 h。即得生物傳感器。

1.2.2 測試方法和原理

2 結果與討論

2.1 傳感器制備過程ECL表征

通過測定修飾電極在2 mL的0.1 mol·L-1PBS(pH=8.0)和1 mL的S2O82-溶液混合溶液中ECL強度變化可以表征傳感器的構建過程。在沉積金的電極表面滴加15 μL DNA鑷子溶液(1 μmol·L-1)并孵育16 h后，ECL強度如圖1中曲線所示，由于DNA鑷子上帶有量子點QD與AF488，但此時DNA鑷子是打開的狀態，所以ECL的信號較低。再滴加10 μL的MCH以封閉電極表面的非特異性結合位點，減少非特異性反應。孵育40 min后進行測定，ECL信號如圖3.1中b所示，由于MCH具有一定阻礙電子傳遞的性質，因此ECL信號有所降低。最后滴加microRNA-21混合溶液，孵育2 h，ECL信號如圖3.1中c所示，由于microRNA-21混合液的加入，使DNA鑷子關閉，量子點與AF488距離很近，因而AF488把能量轉移給量子點，使量子點的ECL信號大大增強。

圖1 傳感器制備過程的ECL表征Fig.1 ECL characterization of sensor preparation process

2.2 傳感器制備過程CV表征

通過測定修飾電極在5 mmol·L-1K3[Fe(CN)6]溶液中CV強度變化來表征傳感器的制備及檢測過程。如圖2所示曲線a是玻碳裸電極的循環伏安圖譜。b是當將納米金修飾在電極表面后測得的曲線，有一對良好的Fe(CN)33-/4-氧化還原峰，這是因為nano-Au具有優良的導電性。曲線c是固載了DNA鑷子，由于DNA鑷子上有熒光材料AF488和量子點，可以加強電子傳遞，所以CV信號增強。曲線d是滴加了MCH封閉劑，由于MCH封閉劑以封閉電極表面的非特異性結合位點，有阻礙電子傳遞的作業，所以CV信號降低。曲線e是滴加了microRNA-21混合液，DNA分子具有阻礙電子傳遞的性質，所以CV信號減弱。通過CV表征說明傳感器成功制備。

圖2 傳感器制備過程CV表征Fig.2 CV characterization of sensor preparation process

2.3 實驗條件的優化

為了使傳感器具有更優異的性能，我們對DNA鑷子溶液的濃度、microRNA-21混合溶液中的DNA酶-鉛離子的濃度進行了優化。

DNA鑷子溶液的優化：首先在沉積金后的電極上分別滴加15 μL 的0.01、0.1、0.5、1、2、3 μmol·L-1)的DNA鑷子溶液，孵育16 h后，再各滴加10 μL的MCH封閉40 min，最后滴加15 μL同一microRNA-21檢測液，孵育2 h，再檢測ECL信號。如圖3所示，在DNA鑷子的濃度低于1 μmol·L-1時，隨著濃度的增大，ECL信號逐漸增強，當DNA鑷子的濃度大于1 μmol·L-1時ECL信號基本保持不變，故DNA鑷子的最佳濃度為1 μmol·L-1。

圖3 DNA鑷子溶液濃度的優化Fig.3 DNA tweezers optimization solution

microRNA-21混合溶液的鉛離子的濃度的優化：首先在沉積金后的電極上滴加15 μL(1 μmol·L-1)的DNA鑷子溶液，孵育16 h后，再滴加10 μL MCH封閉40 min，最后分別滴加15 μL分別含有1、5、10、20、30(μmol·L-1)鉛離子的microRNA-21檢測液，孵育2 h，最后檢查ECL信號。ECL信號如圖4所示，在鉛離子的濃度小于10 μmol·L-1時，隨著濃度的增大，ECL信號逐漸增強。當鉛離子的信號大于10 μmol·L-1時ECL信號基本保持不變，所以鉛離子的最佳濃度為10 μmol·L-1

圖4 Pb2+濃度的優化Fig.4 Optimization of Pb2+ concentration

2.4 ECL生物傳感器的ECL信號響應特性

本實驗研究了在最優條件下ECL生物傳感器孵育了不同濃度的microRNA-21標準混合溶液的傳感器的響應特性。實驗結果表明：如圖5所示，ECL強度隨著microRNA-21濃度的增加而增加。因為microRNA-21的濃度越大DNA鑷子關閉的越多，所以ECL信號越大。在10 pmol·L-1到0.0001 pmol·L-1濃度范圍內，ECL的強度與microRNA-21的濃度呈線性關系(如插圖)。線性方程為I=5876.08+1254.98 lgc，相關系數R為0.99468。檢出限為0.03 fmol·L-1

圖5 傳感器對于不同濃度microRNA-21混合溶液的響應曲線Fig.5 sensor response curves for different concentrations of microRNA-21 mixed solution, concentration of microRNA-21 mixed solution

3 結 論

以ECL為基本檢測手段，我們實現了對microRNA-21的超靈敏檢測。本實驗以具有發光效率高、穩定性好的CdSe@ZnS量子點作為電致化學發光體，選擇發射光譜較寬的熒光材料AF488作為能量轉移供體，量子點作為能量受體接受供體傳遞的能量，從而有較強ECL響應；并且成功構建基于DNA酶引發的目標物循環放大，以DNA分子機器—DNA tweezer為模板的再生型ECL生物傳感器，而實現對microRNA-21的高靈敏檢測，建立了一種特異性強、靈敏度高及檢測快速的microRNA-21檢測方法，對于microRNA的檢測具有非常重要的意義，為microRNA-21檢測及生物傳感領域提供一個新的平臺。