抑制瞬時感受器電位香草素受體亞家族Ⅳ型通道對大鼠視網膜缺血-再灌注損傷后細胞凋亡與新生血管生成的作用▲

齊新剛 顧永欣 肖 云 杜 雷

(1 中國人民解放軍新疆軍區總醫院北京路醫療區全軍眼科中心，烏魯木齊市 830013，電子郵箱：qx98210@163.com；2 新疆醫科大學基礎醫學院，烏魯木齊市 830011)

視網膜缺血-再灌注損傷(retinal ischemia-reperfusion injury,RIRI)是眼科視網膜疾病中一種較為常見的病理過程，主要發生在青光眼、糖尿病性視網膜病變和視網膜血管疾病等有關疾病中，RIRI是導致視力障礙或失明的主要原因[1-2]。研究表明，RIRI可能與眾多因素密切相關，例如氧自由基損傷、細胞內鈣超載及細胞凋亡，最終導致視功能障礙[3]。因此，有必要探討其有效的防治措施。

瞬時感受器電位香草素受體亞家族Ⅳ型(transient receptor potential vanilloid 4,TRPV4)是一種在生物體內普遍表達的非選擇性陽離子通道，作為瞬時感受器電位(transient receptor potential,TRP)通道家族成員之一，TRPV4通道可被包括低滲、溫度、pH和戶外紫外線輻射等一系列刺激所激活[4]。目前，已有研究證明TRPV4參與調節多個細胞內信號傳導途徑和病理生理過程，例如TRPV4通道拮抗劑HC-067047可在口腔、內臟和神經性疼痛疾病中起到鎮痛作用[5]，并具有減輕肺損傷和神經元損傷的作用[6-7]。本研究探討TRPV4通道拮抗劑HC-067047對RIRI后視網膜細胞凋亡和新生血管形成的作用，以期進一步闡明其在RIRI中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物為清潔級雄性SD大鼠30只，4周齡，體質量 180～220 g，購自新疆醫科大學實驗動物中心[合格證號：SCXK(新)2018-0002]。主要試劑：TRPV4抑制劑HC-067047(英國Abcam公司，批號：ab145868)，蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色試劑盒(北京百奧萊博公司，批號：YT165)，脫氧核苷酸末端轉移酶介導的dUTP 缺口末端標記(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)凋亡檢測試劑盒與免疫組化試劑盒(北京中杉生物公司，批號：ZK8005、ZK9600)，TRIzol試劑(美國Invitrogen公司，批號：15596-018)、Prime ScriptTMRT試劑盒與SYBR Premix Ex TaqTMPCR試劑盒(日本TaKaRa公司，批號：RR047A、RR420A)，二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白濃度測定試劑盒、RIPA裂解緩沖液與ECL化學發光液(上海碧云天生物研究所，批號：P0012S、P0013C、P0018S)，兔抗大鼠血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor,PEDF)、膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)抗體(美國Santa Cruz公司，批號：SC-7269、SC-390172、SC-33673)，兔抗大鼠半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase)-3、B細胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)及辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG抗體(美國Abcam 公司，批號：ab32351、ab32124、ab182733、ab181602、ab205718)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠RIRI模型的建立：采用大鼠眼球前房內灌注生理鹽水法建立大鼠RIRI模型[8]。大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(100 mg/kg)全身麻醉后，將大鼠側臥位放置并固定在固定板上，在右眼球上滴加托吡卡胺滴眼液。使用27 G針頭連接生理鹽水輸液袋，打開輸液袋閥門通道，將針尖自大鼠右眼虹膜邊緣緩緩刺入前房，待前房充入生理鹽水脹大后繼續進針，以與右眼虹膜呈45°夾角進針刺破角膜，操作過程中避免損傷虹膜與晶狀體，固定針頭方向，并緩慢松開輸液袋導管夾，使前房內壓力達到 110 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)。采用檢眼鏡觀察大鼠眼睛，見眼底蒼白、水腫且前房變深即為造模成功。持續60 min后關閉輸液閥門通道，拔出針頭，在眼球表面涂抹紅霉素眼膏防止眼球感染。

1.2.2 大鼠分組、給藥及處理：采用隨機數字表法將30只SD大鼠分為3組：對照組、RIRI組和RIRI+HC-067047組，每組10只。RIRI組和RIRI+HC-067047組大鼠按照1.2.1的方法進行RIRI造模，RIRI+HC-067047組大鼠分別在造模后5 h、10 h通過側腦室注射HC-067047(5 μmol/μL)2 μL，對照組和RIRI組大鼠同時給予同等劑量的生理鹽水。分別記錄3組大鼠在治療后第7天、第14天與第21天的體質量。造模與治療過程中無大鼠死亡。在飼養第 21 天時處死所有大鼠，迅速取出大鼠右眼球視網膜組織，一部分置于4%多聚甲醛液中固定，一部分在液氮中冷凍后保存于-80℃冰箱。

1.2.3 HE染色觀察大鼠視網膜組織形態變化：取出固定于4%多聚甲醛液中的各組大鼠視網膜組織，磷酸緩沖鹽溶液沖洗后使用梯度酒精脫水，石蠟包埋，并切成厚度約為4 μm的薄片，脫蠟至水后，蘇木精染色5 min，流水沖洗3次，5 min/次，伊紅染色液染色3 min，經酒精脫水、二甲苯透明后，中性樹膠封片，在WMS-1033光學顯微鏡(上海豫光儀器)200倍下觀察圖像并拍照分析。

1.2.4 TUNEL染色檢測大鼠視網膜神經節細胞凋亡情況：將大鼠視網膜組織石蠟切片置于60℃下烤片2 h脫蠟，加入20 μg/mL不含DNase的蛋白酶K，室溫孵育30 min，然后加入50 μL TUNEL檢測液，在37℃下孵育1 h，再加入50 mL過氧化物酶轉化劑37℃孵育30 min，磷酸緩沖鹽溶液沖洗3次，5 min/次，滴加4′,6-二脒基-2-苯基吲哚染液(博士德生物工程有限公司，批號：AR1177)，室溫避光孵育10 min，中性樹膠封片，于光學顯微鏡下隨機選擇5個高倍(×100)視野，計數1 000個細胞中TUNEL陽性細胞數，陽性細胞數占總細胞數的百分比為凋亡指數。TUNEL染色陽性表現為視網膜組織陽性凋亡細胞的細胞核固縮，染色呈綠色。

1.2.5 免疫組織化學染色檢測Caspase-3、VEGF蛋白陽性表達情況：將大鼠視網膜組織石蠟切片脫蠟至水，將檸檬酸鈉修復液稀釋50倍，取50 mL加熱至95℃，浸入切片進行組織抗原修復，3% H2O2中孵育10 min以封閉內源性過氧化物酶活性，將山羊血清封閉原液用磷酸緩沖鹽溶液稀釋，配制成10%工作液，直接滴在組織切片上，在37℃下孵育1 h，滴加兔抗大鼠Caspase-3(1∶1 000)、VEGF(1∶500)4℃孵育過夜。次日，采用磷酸緩沖鹽溶液洗滌3次，5 min/次，在室溫下與辣根酶標記鏈霉卵白素(美國EarthOx公司，批號：E030100)孵育1 h。用磷酸緩沖鹽溶液再次沖洗3次，5 min/次，滴加二氨基聯苯胺染色，蘇木精復染，使用二甲苯透明，中性樹膠封片，在光學顯微鏡下觀察圖像，陽性細胞呈褐色至棕褐色，隨機選擇5個高倍(×100)視野，計數100個細胞中的陽性細胞數，陽性率為陽性細胞數占總細胞數的百分比。

1.2.6 實時熒光定量PCR法檢測各組大鼠視網膜組織中VEGF、核因子E2相關因子2、缺氧誘導因子1-α mRNA的表達水平：使用TRIzol試劑提取大鼠視網膜組織總RNA。通過Prime ScriptTMRT試劑盒反轉錄合成cDNA。以cDNA為底物進行實時熒光定量PCR 擴增，根據SYBR Premix ExTaqTMPCR試劑盒說明書進行操作，內參基因為GAPDH。PCR擴增體系為cDNA 2 μL，上下游引物各1 μL，SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 12.5 μL，無酶水8.5 μL。擴增條件為95℃，10 min；在以下參數下進行40個循環：95℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min。各基因引物序列由上海生工生物有限公司合成。引物序列如下：VEGF上游引物：5′-GGCGAGGCAGCTTGAGTTAC-3′，下游引物：5′-CTGTCGACGGTGACGATGGT-3′；核因子E2相關因子2(nuclear factor E2 related factor 2,Nrf2)上游引物：5′-CCTTCCTCTGCTGCCATTAGT-3′，下游引物：5′-CCTTCCTCTGCTGCCATTAGT-3′；缺氧誘導因子1α(hypoxia-inducible factor 1α,HIF-1α)上游引物：5′-CGCGAACGACAAGAAAAAGGC-3′，下游引物：5′-CGTATATAAAGATGCGAACTCAC-3′；GAPDH上游引物：5′-GTATGACTCCACTCACGGCA-3′，下游引物：5′-CTCGCTCCTGGAAGATGGT-3′。采用2-ΔΔCt法計算各基因mRNA的相對表達水平。

1.2.7 蛋白質免疫印跡法檢測各組大鼠視網膜組織中PEDF、GFAP、Caspase-3、Bax及Bcl-2蛋白表達水平：取出在液氮中冷凍后置于-80℃冰箱保存的大鼠視網膜組織，剪碎后加入RIPA 裂解緩沖液提取總蛋白，使用BCA試劑盒檢測蛋白濃度。以50 μg蛋白加樣后，通過10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質，電轉印至硝酸纖維素膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBST洗膜3次，5 min/次。加入稀釋后的兔抗大鼠PEDF(1∶5 000)、GFAP(1∶5 000)、Caspase-3(1∶5 000)、Bax(1∶5 000)及Bcl-2(1∶5 000)為一抗，以GAPDH為內參，4℃下孵育過夜。TBST洗膜3次，5 min/次，加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶5 000)，室溫下孵育1 h，TBST洗膜3次，5 min/次，滴加ECL化學發光液顯色曝光，采用凝膠成像系統拍照，采用Image-Pro Plus圖像分析系統對蛋白條帶進行分析。

1.3 統計學分析 采用SPSS 20.0軟件進行統計學分析，計量資料以(x±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠不同時間點體質量的比較 實驗前以及治療后第7、14天，三組的大鼠體質量差異均無統計學意義(均P>0.05)；治療后第21天，RIRI組大鼠體質量低于對照組(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠不同時間點體質量的比較(x±s，g)

2.2 各組大鼠視網膜病理組織學觀察 對照組大鼠視網膜組織結構清楚、各層細胞排列整齊；RIRI組大鼠視網膜組織各層細胞排列雜亂；RIRI+HC-067047組大鼠視網膜厚度增加，視網膜內各層細胞排列趨于規則。見圖1。

圖1 各組大鼠視網膜病理組織學圖像(HE染色，×200)

2.3 各組大鼠視網膜神經細胞凋亡情況 對照組大鼠視網膜幾乎無TUNEL陽性細胞，RIRI組大鼠視網膜出現較多TUNEL陽性細胞，RIRI+HC-067047組大鼠視網膜有少量TUNEL陽性細胞，見圖2。RIRI組和RIRI+HC-067047組細胞凋亡指數均高于對照組，但RIRI+HC-067047組細胞凋亡指數低于RIRI組(P<0.05)，見表2。

圖2 各組大鼠視網膜神經細胞凋亡情況(TUNEL染色，×100)

2.4 各組大鼠視網膜組織Caspase-3、VEGF蛋白陽性表達情況 RIRI組和RIRI+HC-067047組大鼠視網膜組織中Caspase-3、VEGF蛋白陽性表達率均高于對照組，但RIRI+HC-067047組的Caspase-3、VEGF蛋白陽性表達率低于RIRI組(P<0.05)。見表2、圖3、圖4。

表2 各組大鼠視網膜組織神經細胞凋亡指數、Caspase-3與VEGF蛋白陽性表達情況的比較(x±s)

圖3 各組大鼠視網膜組織Caspase-3表達檢測(免疫組織化學染色，×100)

圖4 各組大鼠視網膜組織VEGF表達檢測(免疫組織化學染色，×100)

2.5 各組大鼠視網膜組織中Nrf2、VEGF、HIF-1α mRNA相對表達水平的比較 RIRI組和RIRI+HC-067047組大鼠視網膜組織中Nrf2、VEGF、HIF-1α mRNA相對表達水平均高于對照組，而RIRI+HC-067047組大鼠視網膜組織中Nrf2、VEGF、HIF-1α mRNA相對表達水平低于RIRI組(P<0.05)，見表3。

表3 3組大鼠視網膜組織中Nrf2、VEGF、HIF-1α mRNA相對表達水平的比較(x±s)

2.6 各組大鼠視網膜組織中PEDF、GFAP、Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達水平的比較 RIRI組和RIRI+HC-067047組大鼠視網膜組織中PEDF、Bcl-2蛋白表達水平較對照組下降，GFAP、Caspase-3、Bax蛋白表達水平較對照組升高(P<0.05)；與RIRI組比較，RIRI+HC-067047組中PEDF、Bcl-2蛋白表達水平升高，GFAP、Caspase-3、Bax蛋白表達水平下降(P<0.05)，見圖5與表4。

圖5 各組大鼠視網膜組織中PEDF、GFAP、Caspase-3、Bax及Bcl-2蛋白表達檢測

表4 3組大鼠視網膜組織中PEDF、GFAP、Caspase-3、Bax及Bcl-2蛋白相對表達水平的比較(x±s)

3 討 論

RIRI是常見的眼科臨床疾病，主要發生在視網膜內側。視網膜缺血是由于視網膜血液供應減少而導致氧氣和其他營養元素向視網膜內部層輸送減少所致，缺血后血液的再灌注與氧化應激、炎癥反應等密切相關[9-10]。RIRI可引起神經元損失、視網膜形態變性以及視網膜功能的喪失，最終將會導致失明。急性高眼壓時視網膜氧分壓降低，且缺血缺氧會導致視網膜病理學改變與一系列的代謝障礙[11]。本研究運用前房生理鹽水灌注法來構建大鼠RIRI模型，觀察發現RIRI組大鼠視網膜組織結構發生明顯的變化，各層細胞排列雜亂，且視網膜神經纖維層較正常大鼠變薄。此外，體質量可反映或長或短時間內營養狀況的變化，它能評價體內的營養情況，尤其是放映能量的攝取與消耗是否平衡以及脂肪在體內的增加或減少的一個重要指標，也是反映疾病嚴重程度和預后的一個重要指標。本研究結果顯示，治療后第21天，RIRI大鼠的體質量較對照大鼠降低，提示大鼠體內出現了病變。

TRP通路包含大量陽離子通道，大部分可滲透Ca2+，類香草素受體為TRP亞家族之一，由TRPV1、TRPV2、TRPV3、TRPV4、TRPV5和TRPV6組成[12]。已有研究表明，TRPV4通道激活可引起Ca2+內流，在腦缺血再灌注損傷中具有至關重要的作用[13]。在本研究中，給予RIRI大鼠TRPV4抑制劑HC067047干預后，大鼠視網膜組織病理變化明顯減輕，推測抑制TRPV4通道可能可以減輕 RIRI大鼠視網膜損傷。

RIRI引起代謝紊亂、能量消耗和一系列后續反應，例如自由基產生、線粒體功能障礙、炎癥反應、鈣蛋白酶和半胱天冬酶的活化，導致視網膜細胞凋亡[14]。作為細胞凋亡的經典途徑，Caspase-3是Caspases的主要效應物，是細胞凋亡的關鍵執行蛋白。本研究結果顯示，治療后第21天，RIRI大鼠視網膜中TUNEL 陽性細胞增加，促凋亡蛋白Caspase-3和Bax表達增加，而抑凋亡蛋白Bcl-2表達減少(P<0.05)。經過HC067047干預后，RIRI大鼠視網膜中TUNEL陽性細胞數目明顯減少，Caspase-3和Bax表達減少，Bcl-2表達增加(P<0.05)。說明抑制TRPV4通道可減少RIRI大鼠視網膜細胞凋亡，從而發揮保護視網膜的作用。

血管新生是一個多因子參與的復雜生理與病理過程，涉及多個信號通路之間的相互作用。在RIRI過程中，血管網向外不斷延伸，血管通透性改變，導致血漿發生滲漏，玻璃體后皮質與視網膜分離，對視覺功能產生嚴重影響[15]。因此，視網膜新生血管形成是RIRI損傷的重要表現。VEGF和PEDF分別具有促進新生血管形成和抑制新生血管形成的作用[16]，兩者表達平衡對RIRI至關重要。GFAP 為中間絲骨架蛋白，對視網膜細胞膠質增殖起到重要作用[17]。而Nrf2可通過介導下游一系列抗氧化物的合成和表達來調節體內氧化平衡，HIF-1α不僅可以通過介導相關轉錄因子來適應機體組織的缺氧，還可以通過調節VEGF的表達來促進新生血管形成[18]。與RIRI組大鼠比較，經過HC067047干預后，RIRI大鼠視網膜組織中VEGF細胞陽性率下降，Nrf2、VEGF、HIF-1α的mRNA相對表達水平下降，同時PEDF蛋白表達水平升高而GFAP蛋白表達水平下降(P<0.05)。由此推斷，抑制TRPV4通道可抑制RIRI大鼠視網膜新生血管的形成。

綜上所述，抑制TRPV4通道能夠減少視網膜細胞凋亡，并且可以抑制視網膜新生血管的形成，從而對RIRI大鼠視網膜損傷發揮保護作用。但RIRI 病理機制復雜，HC-067047的應用是否存在副作用仍需深入研究探討。