一株磺胺二甲嘧啶抗性菌的篩選及抗性機制研究

車 琦， 王繼華， 崔 紅， 黃 涵

哈爾濱師范大學， 黑龍江 哈爾濱 150025

抗生素的不合理與大量使用，在全球范圍內引起廣泛關注，已被視為對生物體和人類健康的新威脅[1]. 磺胺類藥物(sulfonamides, SAs)價廉、廣譜，廣泛用于畜牧、醫藥臨床等領域，且可以通過甲氧芐啶(trimethoprim, TMP)提高其抗菌活性，增強普遍適用性，擴大抗菌治療范圍[2-4]. SAs因在體內不能完全代謝，30%～90%的母體大分子會隨代謝廢物進入環境[5-6]，且難以被自然降解[7]，已在各類水環境中檢測出其殘留濃度在ng/L～mg/L級別[8-9]. 磺胺二甲嘧啶(sulfadimidine, SMZ)作為典型的SAs，廣泛用于動物疾病的防御與治療[10]. 在自然水體中的殘存濃度最高可達104ng/L，風險較高[11-14]，且極易誘發和傳播抗性菌(antibiotics resistance bacteria, ARB)及抗性基因(antibiotics resistance genes, ARGs)[15-17]. 同時，ARB消亡后，其攜帶ARGs的裸露DNA可在微生物之間再次傳播[18-20].

抗生素抗性數據庫(comprehensive antibiotic resistance database, CARD)已列示的19個磺胺類ARB屬中，不動桿菌屬(Acinetobacter)和假單胞菌屬(Pseudomonas)具備多重抗性[21-23]. 研究[24-25]發現，ARB攜帶的磺胺類ARGs主要有sul1、sul2和sul3，sul1基因組成Int1基因的3′保守區段，sul2、sul3基因在菌株質粒中被發現[26]. TMP的ARGs主要包括dfrA與dfrB兩大類，載體為整盒子，與磺胺類ARGs共存[27]. Wang等[21]在不動桿菌屬、芽孢桿菌屬和無色桿菌屬中均檢測到磺胺類ARGssul1、sul2、sul3以及甲氧芐啶ARGsdfrA. Smiline等[22]對鮑曼不動桿菌編碼ARGs質粒的研究發現，編碼dfrA1基因的ARB有17.8%同時編碼sul1、sul2基因，均可由質粒、整合子、轉座子等可移動元件介導傳播，且SAs的抗性機制與dfrA1、sul1和sul2基因的遺傳有關[28]. 進一步研究發現，ARB可通過改變藥物作用靶位、主動外排藥物、改變孔蛋白阻止抗生素滲透等機制對抗生素產生抗性[29]. 而SAs導致細菌抗性的機制主要是ARGs編碼蛋白改變藥物“旁路”代謝途徑[30-31].

目前，地下水中SAs污染的研究主要集中在SAs的檢測、ARGs檢出水平及生態風險評價等方面[32-33]. 該研究基于傳統微生物培養技術從地下水中篩得一株SMZ抗性菌，在形態學觀察、生理生化試驗、16S rRNA 基因測序的基礎上，通過熒光定量PCR與普通PCR定量對磺胺類ARGs、甲氧芐啶ARGs以及Int1基因進行檢測，結合NCBI同源性比對、KEGG功能注釋，分析其抗性特性及抗性機制，以期為研究地下水中SAs抗性菌的環境行為、抗性機制以及抗生素風險評估提供數據支持.

1 材料與方法

1.1 水樣的采集與處理

地下水樣取自北京市東南發展區地下水監測井(60～80 m)，取樣容器經甲醇(Thermo Fisher Scientific, AR)和乙醇(>95%，AR)多次潤洗，樣品采集后保存在冰盒中運回實驗室. 一部分樣品經過濾、調節pH、加內標后，在24 h之內完成固相萃取，萃取后的樣品采用高效液相色譜-串聯質譜法檢測SAs殘留；另一部分樣品經4 ℃保存，用于微生物篩選.

由圖1(a)可知，地下水樣品中除TMP外共檢測到7種SAs，分別為磺胺地索辛(SDM)、磺胺嘧啶(SDZ)、磺胺芐胺(SML)、磺胺二甲嘧啶(SMZ)、磺胺甲基嘧啶(SMR)、磺胺甲惡唑(SMX)和磺胺噻唑(STZ)，其中SMZ檢出濃度最高，為 11 112 ng/L. 根據Verlicchi等[34-35]提出的風險熵(risk quotiet，RQ)評估模型，將RQ值劃分為生態風險的3個級別(RQ>1 表示高風險，0.11，為潛在高風險優先管控物質〔見圖1(b)〕.

1.2 SMZ抗性菌的富集、分離、純化

SMZ儲備液：以甲醇做溶劑，經0.22 μm濾膜(津騰)過濾后避光保存在4 ℃冰箱，保存時間不超過7 d.

培養基：液體LB肉湯培養基和固體LB肉湯培養基中添加SMZ儲備液用于菌株的富集與篩選.

取10 mL地下水樣品，加入到90 mL液體LB培養基中，SMZ的濃度為1 mg/L，置于恒溫水浴振蕩培養箱(37 ℃、150 r/min)中培養15 d，完成第1周期富集. 利用高速冷凍離心機，PBS緩沖液制備第1周期菌懸液，取10 mL菌懸液，同第1周期培養條件進行第2周期的富集，此時SMZ的濃度為5 mg/L. 按照上述方法，依次完成后續3個周期的富集，SMZ濃度梯度依次為10、15、20 mg/L. 取第5周期富集液，用滅菌的生理鹽水進行梯度稀釋，均勻涂布于SMZ濃度為20 mg/L的固體LB培養基平板上，在37 ℃恒溫生化培養箱中培養24～48 h，挑取單菌落進行菌株純化，最終篩得一株SMZ抗性菌，命名為SMZ-R9.

1.3 SMZ抗性菌的鑒定

形態學觀察：菌株置于37 ℃恒溫培養24 h，觀察菌株純化過程中形成單菌落的大小、顏色、形狀、邊緣、質地、透明度等，并通過革蘭氏染色記錄菌株細胞大小.

生理生化試驗：測定微生物增殖過程中代謝產物的生理生化反應是微生物分類鑒定的重要依據，觀察某些化學反應，如糖發酵產酸產堿、檸檬酸鹽產酸產堿、甲基紅產酸、硝酸鹽還原、伏普糖代謝、尿素酶、接觸酶、氧化酶、淀粉酶酶催化等固有現象進行試驗鑒定，試驗結果參考《伯杰氏鑒定手冊》.

分子生物學鑒定(16S rRNA)：將固體LB培養基上分離得到的純種菌株進行16S rRNA基因序列測定(上海生工生物工程技術服務有限公司)，利用NCBI數據庫對測序結果進行同源性比對，選取10條以上同源性較高的序列，利用MEGAX軟件構建系統發育樹.

1.4 菌株抗性特征及機制分析

以3種磺胺類ARGs、2種甲氧芐啶ARGs以及Int1基因為目標基因，對SMZ-R9菌株中的ARGs進行熒光定量PCR(BioRad CFX96 Touch，美國)檢測. 引物信息如表1所示.

表1 ARGs引物信息

qPCR采用20 μL體系，包含10.0 μL SYBR Premix Ex TaqTM(TaKaRa)，引物各0.4 μL，DNA模板1 μL及ddH2O 8.2 μL. 反應程序為95 ℃預變性1～2 min，95 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環. 溶解曲線溫度為55～95 ℃，每0.5 ℃讀數一次，期間停留30 s，測定時將標準質粒以10倍梯度稀釋，再根據質粒濃度計算得到標準質粒的拷貝數，多次重復，計算檢出率.

近年來，基于試驗方法的優化，蛋白質功能預測準確性提高，利用蛋白質同源性分析或結合結構數據庫Cdd[36]、Pfam[37]等進行功能注釋研究時發現，同源性蛋白擁有相似甚至相同的生化功能[38]. 因此，將菌株SMZ-R9檢出率最高的磺胺類ARGs和甲氧芐啶ARGs作為目的基因進行普通PCR定性檢測，并對核酸序列進行解析獲得蛋白序列信息，通過NCBI數據庫與KEGG數據庫進行序列同源性比對與功能注釋，解析菌株SMZ-R9的SAs抗性特征及抗性機制.

2 結果與討論

2.1 菌株鑒定

如圖2(a)菌落形態所示，菌株SMZ-R9的菌落呈現暗白色、圓形、有黏性、邊緣不齊無光澤；如圖2(b)細胞形態所示，菌株細胞呈短桿狀，革蘭氏染色鑒定為陰性菌. 如表2所示，氧化酶反應、硝酸鹽反應呈陰性，接觸酶反應呈陽性，糖發酵不產堿，參照《伯杰氏鑒定手冊》，初步判定與不動桿菌屬生理生化特征較為相似. 經16S rRNA基因測序及序列同源性比對，SMZ-R9與多株不動桿菌的序列相似性較高；根據系統進化分析(見圖3)發現，SMZ-R9與Acinetobacterlactucaestrain同源性為97%. 因此，鑒定菌株SMZ-R9為乳酸不動桿菌(Acinetobacterlactucae).

圖2 菌株SMZ-R9形態學鑒定

表2 菌株SMZ-R9生理生化鑒定結果

圖3 菌株SMZ-R9的16S rRNA系統發育樹

2.2 抗性特征分析

如表3所示：菌株SMZ-R9磺胺類ARGssul2檢出率最高，為69.05%，sul3基因檢出率最低，為19.05%；Int1、sul1基因檢出率分別為54.76%與64.29%，可能與sul1基因與Int1基因片段重合有關[26]；甲氧芐啶ARGsdfrA1檢出率為40.48%，dfrA12未檢出.

表3 SMZ-R9菌株ARGs檢出率

以檢出率最高的磺胺類ARGssul2和甲氧芐啶ARGsdfrA1作為目的基因，進行基因擴增測序、序列解析及同源性分析，結果如圖4所示. 由圖4(a)可見，sul2基因編碼蛋白與鮑曼不動桿菌二氫蝶呤合成酶(DHPs，QBR76772.1)、二氫蝶呤合成酶(sul1)(DHPs，AAA22697.1)的同源性均為100%. DHPs是一種功能性同型二聚體，在生物合成葉酸的過程中催化對氨基苯甲酸(pABA)的縮合，是核酸和蛋白質生物合成中不可或缺的輔助因子[39]. 如圖4(b)所示，dfrA1基因編碼蛋白與耐甲氧芐啶二氫葉酸還原酶(DHFR，WP010890144.1)的同源性為99%. DHFR是一種質粒編碼的酶，參與介導細菌的抗性，與染色體編碼的DHFR有一定的相似性[40].

圖4 SMZ-R9菌株ARGs蛋白同源性比對

2.3 抗性機制分析

葉酸參與微生物的生物合成與氨基酸代謝，在SAs環境壓力下，菌株SMZ-R9體內四氫葉酸的合成受磺胺類ARGssul2和甲氧芐啶ARGsdfrA1的調控. 如圖5所示，SAs與pABA具有相似結構，與底物pABA競爭蝶啶結合位點，導致細菌體內葉酸合成受阻，細菌生長、繁殖受挫[41-42]. SMZ-R9質粒基因sul2編碼產生DHPs(EC 2.5.1.15)，可作為二氫葉酸前體二氫蝶酸合成的關鍵酶，催化蝶啶與pABA合成二氫蝶酸，導致SAs競爭抑制降低，葉酸上游合成途徑不受影響，SMZ-R9對SAs獲得抗性. 部分研究也在革蘭氏陽性細菌中分離出由sul1和sul2編碼的DHPS1型和DHPS2型產物[43].

圖5 SMZ-R9菌株抗性機制分析

SAs的靶標DHPs是葉酸途徑中DHFR的上游酶[44]，TMP是一種二氨基嘧啶類藥物，與SAs之間起協同作用，以高于二氫葉酸的親和力與DHFR結合，抑制酶的活性，干擾葉酸合成的下游途徑[45]. 菌株SMZ-R9攜帶的dfrA1屬于A類dfr基因家族，這些基因間氨基酸序列有64%～88%的同源性，介導高水平的抗性[46].dfrA1編碼產生的DHFR(EC 1.5.1.3)即甲氧芐啶抗性蛋白，催化SMZ-R9菌株葉酸合成下游途徑，促使二氫葉酸還原成四氫葉酸，參與生物合成及代謝. 以上研究表明，sul2基因與dfrA1基因表達產物催化菌株SMZ-R9的葉酸正常合成，生物合成與代謝得以順利進行，細菌生長、繁殖未受SAs影響，即對SAs產生抗性.

3 結論

a) 從地下水中篩得一株SMZ抗性菌SMZ-R9，經形態學觀察、生理生化試驗及16S rRNA基因測序鑒定后，確定為乳酸不動桿菌(Acinetobacterlactucae)，屬于革蘭氏陰性細菌.

b) SMZ-R9同時攜帶3種磺胺類ARGs(sul1、sul2、sul3)、1種甲氧芐啶ARGs(dfrA1)以及Int1基因.

c)sul2、dfrA1基因為編碼DHPs與DHFR的核酸序列，表達產物分別催化葉酸合成的上游途徑，pABA與蝶啶反應生成二氫蝶呤，以及下游途徑二氫葉酸還原成四氫葉酸，共同介導菌株SMZ-R9的SAs抗性.