丹參酚酸B對間歇性高糖乳鼠雪旺細胞損傷的改善*

王蒙 王倩倩 孫連慶

(西安交通大學第一附屬醫院中醫科，陜西 西安 710061)

高血糖引起的血管病變是導致糖尿病患者出現各種慢性并發癥的病理基礎[1-2]。糖尿病患者體內主要存在穩定性高血糖及間歇性高血糖這兩種狀態，近年研究表明間歇性高血糖較穩定性高血糖更容易對靶器官造成損傷[3-5]。雪旺細胞是糖尿病周圍神經病變(Diabetic Peripheral Neuropathy,DPN)的主要靶細胞，作為周圍神經系統特有的神經膠質細胞，對雪旺細胞的保護無疑是治療DPN的重要手段。我們通過前期研究發現丹參酚酸 B(salvianolic acid B,Sal B)可以抑制高糖誘導的雪旺細胞凋亡[6-7]。在此基礎上，本研究以體外培養的乳鼠雪旺細胞為模型，進一步探討丹參酚酸B對間歇性高糖狀態下雪旺細胞的保護作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 選取出生3～5 d清潔級Wistar乳鼠，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[SCXK(京)2009-0007]。實驗過程符合動物倫理要求，并嚴格按照西安交通大學醫學部倫理委員會批準的實驗方案進行。

1.1.2 主要試劑與儀器 流式細胞儀(美國BD公司)；丹參酚酸B(天津馬克生物有限公司)；MTT(美國Sigma公司)；兔抗鼠S-100抗體、HRP標記二抗(北京中杉金橋公司)；雙氫-乙酰乙酸二氯熒光黃(DCFH-DA,美國Molecular Probes公司)；線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1,北京嘉美生物)；丙二醛(MDA)測定試劑盒、超氧化物歧化酶 (SOD)測定測試盒(南京建成生物有限公司)；TUNEL凋亡檢測試劑盒(美國Roche公司)；兔抗鼠anti-bcl-2、anti-bax、anti-AIF(美國Santa Cruz公司)，兔抗鼠anti-caspase-9、anti-caspase-3(美國CST公司)。

1.2 方法

1.2.1 雪旺細胞的培養、純化及鑒定 脫頸處死后的乳鼠經75%乙醇浸泡消毒，無菌條件下分離坐骨神經，組織貼塊法及差速貼壁法進行培養并去除混雜的成纖維細胞，G-418純化后S-100抗體鑒定。選擇生長良好的第3代雪旺細胞進行實驗。

1.2.2 Sal B藥物濃度篩選 待對數生長期細胞均勻鋪滿96孔板底面后，以不同濃度Sal B(6.25、12.5、25、50、100、200、400 μmol/L)處理細胞，空白對照組為不加Sal B的細胞，每組5～6 個復孔。MTT法計算不同濃度Sal B對雪旺細胞的抑制率。選擇細胞生長形態最好，活力最佳且抑制率最低的3個Sal B濃度(25、50及100 μmol/L)進行后續實驗。

1.2.3 實驗分組與處理 根據前期工作基礎選擇50 mM葡萄糖及48 h作為高糖濃度及干預時間[7]。無血清培養基同步化處理細胞后進行分組：①正常葡萄糖對照組(con組)：5.6 mmol/L葡萄糖。②穩定性高糖組(HG組)：50 mmol/L葡萄糖。③間歇性高糖組(IHG組)：5.6 mmol/L葡萄糖與50mmol/L葡萄糖交替培養，每8 h換液1次。④間歇性高糖加不同濃度的Sal B處理組，使Sal B濃度分別為25、50及100 μmol/L。

1.2.4 MDA含量、SOD活性測定 收集各組細胞培養液，離心取上清，按照試劑盒說明書進行檢測。

1.2.5 細胞內活性氧(Reactive oxygen species,ROS)檢測 各組細胞懸浮于熒光探針DCFH-DA(10 μmol/L)中，每3～5 min顛倒混勻。以流式細胞儀測定的各組細胞平均熒光強度代表ROS水平。

1.2.6 線粒體膜電位(MMP)檢測 JC-1熒光探針進行檢測，流式細胞儀以激發波490 nm,發射波530 nm及激發波525 nm,發射波590 nm檢測細胞的紅綠熒光強度，通常以紅綠熒光的相對比例來衡量MMP高低。

1.2.7 細胞凋亡檢測 多聚賴氨酸包被蓋玻片上培養的各組細胞，多聚甲醛固定，TritonX-100打孔，加入TUNEL反應液避光孵育。DAB顯色，鏡下觀察，出現棕黃色顆粒即終止反應。雪旺細胞核呈深棕黃色圓形或橢圓形顆粒者為陽性，每組隨機選5個視野，通過凋亡細胞數/總細胞數計算凋亡率。

1.2.8 Western blot檢測凋亡相關蛋白 裂解各組細胞得到蛋白,定量并調整濃度，經電泳、轉膜、室溫封閉后，分別加入不同濃度兔抗鼠Bcl-2(1∶200)、Bax(1∶200)、AIF(1∶200)，Cleaved-caspase-9(1∶800)、Cleaved-caspase-3(1∶800)抗體4 ℃過夜，HRP標記，ECL顯色、曝光、顯影。測定雜交條帶光密度值進行分析。

2 結果

2.1 雪旺細胞形態、鑒定及純度 純化后的雪旺細胞呈梭型，核呈卵圓形，胞體較小且飽滿，周圍有細長突起，呈現“端對端”、“極對極”的網狀或旋渦狀聚集生長。經鑒定雪旺細胞的純度達95%以上。

2.2 各組培養液中MDA含量及SOD活性變化 與Con組及HG組相比，IHG組細胞培養液中MDA含量明顯增高 (P<0.01)，SOD活性明顯降低 (P<0.01)。與IHG組相比，不同濃度Sal B干預后，各組細胞培養液中MDA含量明顯下降(P<0.01,P<0.05)，而SOD活性明顯增高(P<0.01,P<0.05)。見表1。

2.3 各組細胞內ROS水平變化 IHG組ROS水平明顯高于HG組及Con組 (P<0.01)。與IHG組相比，不同濃度Sal B可以降低雪旺細胞內ROS水平 (P<0.01)。見表1。

2.4 各組細胞凋亡率比較 IHG組細胞凋亡率明顯高于HG組及Con組 (P<0.01)。與IHG組相比，不同濃度Sal B組雪旺細胞凋亡率明顯下降 (P<0.05,P<0.01)。見表1。

2.5 各組細胞MMP變化 IHG組細胞MMP明顯低于Con組及HG組(P<0.01,P<0.05)。與IHG組相比，不同濃度Sal B干預后，各組雪旺細胞MMP明顯增高 (P<0.05,P<0.01)。見表1。

表1 各組細胞凋亡率、MMP、活性氧、MDA及SOD水平變化Table 1 Comparison of apoptosis rate,mitochondrial transmembrane potential,levels of ROS,MDA and SOD in each group

2.6 各組細胞Bcl-2/Bax、Caspase-9及Caspase-3變化 與Con組相比，HG組和IHG組Bcl-2水平明顯下降 (P<0.01)，Bax、Cleaved-caspase-9及Cleaved-caspase-3水平明顯增高 (P<0.01)，間歇性高糖的作用比穩定性高糖更為明顯 (P<0.01)。與IHG組相比，經不同濃度Sal B干預后，雪旺細胞內Bcl-2水平明顯增高(P<0.01,P<0.05)，Bax、Cleaved-caspase-9、Cleaved-caspase-3水平顯著降低(均P<0.01)。見圖1。

圖1 Western blot 檢測細胞凋亡相關蛋白情況Figure 1 Detection of apoptosis related protein in each group注：與Con組比較，①P<0.01；與HG組比較，②P<0.01；與IHG組比較，③P<0.05，④P<0.01

2.7 Sal B對IHG組雪旺細胞AIF表達的影響 從線粒體到細胞核的轉位是AIF的活化標志，與Con組和HG組比較，IHG組雪旺細胞線粒體AIF表達水平降低，而細胞核中AIF表達水平相應增高 (P<0.01)。與IHG組比較，不同濃度Sal B組雪旺細胞線粒體AIF表達水平增高，細胞核中AIF表達水平降低 (P<0.05,P<0.01)。見圖2。

圖2 Western blot 檢測AIF核轉位情況Figure 2 Nuclear translocation of AIF in each group 注：與Con組比較，①P<0.01；與HG組比較，②P<0.01；與IHG組比較，③P<0.05,④P<0.01

3 討論

絕大多數糖尿病患者都存在一定幅度的血糖波動，既往人們只重點關注慢性穩定性高血糖，而相對忽略了間歇性高血糖對人體的損害。Monnier等[8-9]發現間歇性高糖更容易誘發并加劇氧化應激反應，間歇性高糖環境下血管內皮細胞出現嚴重的功能障礙。分析其原因可能是由于間歇性高糖通過激活內皮細胞氧化應激通路和信號轉導途徑，進一步啟動了內皮細胞凋亡程序并加速其損傷。因此，目前普遍認為相對于慢性穩定性高血糖，間歇性高血糖更能影響并促進糖尿病各種慢性并發癥發生發展[10-11]。

雪旺細胞作為髓鞘形成細胞，對于周圍神經結構功能的維持及損傷修復起著非常重要的作用[12-14]。雪旺細胞內富含豐富的線粒體，而負責轉運葡萄糖的受體是非胰島素依賴性的，這就使雪旺細胞更容易受到高血糖的刺激，進而直接或間接出現氧化應激損傷[15-16]。氧化應激反應會降低線粒體膜電位，Cyto c、AIF等因子通過從線粒體膜間腔轉位到細胞漿及細胞核中，從而啟動了細胞凋亡過程[17-18]。Cyto c在胞漿內結合Caspase-9后激活下游的Caspase-3,通過caspase依賴性途徑導致細胞凋亡。而AIF的核轉位則可以通過非Caspase途徑啟動凋亡。

本研究建立間歇性高糖誘導的雪旺細胞損傷模型，檢測細胞氧化應激水平及凋亡的變化，結果顯示穩定性高糖和間歇性高糖可以明顯加劇雪旺細胞氧化應激損傷，表現為ROS水平及MDA含量的增加，SOD活性的下降。同時穩定性高糖和間歇性高糖可以降低線粒體膜電位，下調Bcl-2表達，上調Bax表達，促進AIF的核轉位及Caspase-9、Caspase-3 的活化，增加了雪旺細胞凋亡。與穩定性高糖相比，間歇性高糖的作用更為明顯。

目前間歇性高糖導致細胞損傷的具體機制尚未完全明確，大部分學者認為長期高濃度葡萄糖環境下，細胞代謝為了適應高糖的損傷效應會發生代償性改變。而不斷變化的葡萄糖濃度則會導致細胞無法及時建立有效的適應性改變，從而引發了更為嚴重的細胞功能損傷[11,19-20]。

丹參酚酸B是丹參主要的水溶性單體,既往研究表明其具有抗氧化應激及神經保護作用[21]。本研究發現丹參酚酸B可以改善間歇性高糖誘導的雪旺細胞氧化應激損傷及凋亡，表現為降低雪旺細胞內ROS水平及MDA含量，提高SOD活性。同時上調Bcl-2表達，下調Bax表達，抑制AIF的核轉位及Caspase-9、Caspase-3 的活化。這表明丹參酚酸B對間歇性高糖導致的雪旺細胞損傷具有一定的保護作用。

4 結論與啟示

間歇性高糖較持續穩定性高糖對于雪旺細胞具有更顯著的損傷作用，丹參酚酸B能通過抑制氧化應激反應減輕間歇性高糖誘導的乳鼠雪旺細胞凋亡。因此，嚴格控制血糖，減少血糖波動對控制糖尿病周圍神經病變的發生發展具有重要意義。但本實驗為體外實驗，在動物及人體內丹參酚酸B是否同樣有效，尚需在今后的研究中進一步證實。