探索1種地表水中糞大腸菌群測定的方法

王海宏 史俞娜 駱佳慧 張瑤琴

（浙江人欣檢測研究院股份有限公司 浙江寧波 315000）

糞大腸菌群，又稱耐熱大腸菌群，是1種能在44.5 ℃高溫下仍可生長繁殖并且能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧及兼性厭氧革蘭氏陰性無芽孢桿菌。它主要來源于人畜糞便，地表水中糞大腸菌群的檢測有利于了解水體是否被糞便污染。目前糞大腸菌群的檢測方法有多管發(fā)酵法、快速紙片法、濾膜法、酶底物法、熒光原位雜交（FISH）技術(shù)、聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）技術(shù)等［1-3］。上述方法各有優(yōu)缺點，基于成本與操作性的考慮，最常用的檢測方法為多管發(fā)酵法（15 管），其優(yōu)點為所需儀器比較常見且便宜，實驗較容易操作，但該方法的缺點是需要復發(fā)酵進行驗證，耗時較長。糞大腸菌群中存在乳糖操縱子，乳糖操縱子是參與乳糖分解的一個基因群，所以糞大腸菌群的特性之一是發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣。一般在乳糖存在時，乳糖操縱子即可被誘導，乳糖被β-半乳糖苷酶催化生成異乳糖，這種異乳糖能被分解，從而產(chǎn)酸產(chǎn)氣。異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（英文簡稱“IPTG”）是1種強誘導劑且不能被分解，是β-半乳糖苷酶的活性誘導物質(zhì)，它的存在使β-半乳糖苷酶持續(xù)保持活性，催化分解乳糖。5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（英文簡稱“X-gal”），是β-半乳糖苷酶的底物，水解后呈藍色。本文采用直接培養(yǎng)法，在EC 肉湯培養(yǎng)基中加入X-gal 溶液和IPTG 溶液，IPTG 誘導表達β-半乳糖苷酶，這能使生色底物X-gal 變成藍色物質(zhì)，直接在（44.5±0.5）℃培養(yǎng)（24±2）h 就能觀察結(jié)果，如產(chǎn)氣并且發(fā)酵管中有藍色物質(zhì)生產(chǎn)證實為糞大腸菌群陽性。由于最初培養(yǎng)溫度就是44.5 ℃，從而排除了其它菌屬，避免造成結(jié)果假陽性。該方法與多管發(fā)酵法相比，檢測時間減少一半，操作比較簡單。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

乳糖蛋白胨培養(yǎng)液（20190305-00，杭州微生物試劑有限公司）；EC 肉湯（20170419-00，杭州微生物試劑有限公司）；Xgal 溶液（20 mg/mL，索萊寶）；IPTG 溶液（50 mg/mL，索萊寶）；大腸埃希氏菌（ATCC25922，上海魯微科技有限公司）；產(chǎn)氣腸桿菌（ATCC13048，上海魯微科技有限公司）；立式壓力蒸汽滅菌鍋（BXM-30R，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；生化培養(yǎng)箱（LRH-250，上海一恒科學儀器有限公司）；凈化工作臺（SW-CJ-2FD，上海博迅實業(yè)有限公司）。

1.2 方法

稱取23 g 乳糖蛋白胨培養(yǎng)基溶于1 000 mL 純水中，溶解后取10 mL 分裝至有小倒管的試管中，115 ℃高溫蒸汽滅菌20 min 備用。稱取37g EC 肉湯培養(yǎng)基溶于1 000 mL 純水中，溶解后取10 mL 分裝至有小倒管的試管中，121 ℃高溫蒸汽滅菌15 min 備用。

配制15 管EC 肉湯培養(yǎng)基（含有X-gal 溶液和IPTG 溶液）：在超凈工作臺中按無菌操作要求將20 μL X-gal 溶液（20 mg/mL）和10 μL IPTG 溶液（50 mg/mL）分別加入各試管中。

將實驗分為2 組，第1 組采用直接培養(yǎng)法：取3 個污染程度不同的地表水樣，按無菌操作要求將1 mL、0.1 mL、0.01 mL接種于15 管EC 肉湯培養(yǎng)基（含有X-gal 溶液和IPTG 溶液）中，每個接種量接5 管，當樣品接種量小于1 mL 時，應(yīng)將樣品制成稀釋樣品后使用。按無菌操作要求方式吸取10 mL 充分混勻的樣品，注入盛有90 mL 無菌水的三角燒瓶中，混勻成1∶10稀釋樣品。吸取1∶10的稀釋樣品10 mL 注入盛有90 mL 無菌水的三角燒瓶中，混勻成1∶100 稀釋樣品。其他接種量的稀釋樣品依次類推。將接種后的試管，在（44.5±0.5）℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（24±2）h，然后觀察結(jié)果。發(fā)酵試管顏色出現(xiàn)藍色絮狀物質(zhì)，并且小玻璃倒管內(nèi)有氣泡，這樣的試管證實為糞大腸菌群陽性；如果發(fā)酵試管中的藍色絮狀物質(zhì)不明顯，可以將發(fā)酵試管放置4 ℃冰箱中約0.5 h，然后觀察發(fā)酵試管的顏色。第2組采用多管發(fā)酵法，具體步驟參考《水質(zhì)糞大腸菌群的測定多管發(fā)酵法》（HJ 347.2—2018）。

2 結(jié)果與討論

2.1 標準菌株的測定

采用2種方法對陽性菌株（大腸埃希氏菌Escherichia coli）、陰性菌株（產(chǎn)氣腸桿菌Enterobacter aerogenes）和空白對照組進行實驗。直接培養(yǎng)法的實驗結(jié)果顯示陽性菌株存在的試管產(chǎn)氣并出現(xiàn)藍色物質(zhì)，陰性菌株存在的試管和空白對照組既不產(chǎn)氣也不出現(xiàn)藍色物質(zhì)。多管發(fā)酵法的實驗結(jié)果顯示在初發(fā)酵階段陽性菌株和陰性菌株均產(chǎn)酸產(chǎn)氣，空白對照組既不產(chǎn)酸也不產(chǎn)氣，復發(fā)酵階段陽性菌株產(chǎn)氣，陰性菌株不產(chǎn)氣。

實驗結(jié)果表明直接培養(yǎng)法對糞大腸菌群的檢測具有專一性。

2.2 實際樣品的測定

取3 個污染程度不同的地表水樣品分別采用上述2種方法進行糞大腸菌群的測定，按照多管發(fā)酵法原理計算糞大腸菌群數(shù)。實驗結(jié)果表明直接培養(yǎng)法的3 個樣品的測定結(jié)果均在標準法95%置信限值內(nèi)，該方法的準確性能滿足日常檢測的要求，然而在低濃度樣品的測定結(jié)果略低于多管發(fā)酵法的測定值，該結(jié)果與呂琦等［4］將地表水樣直接接種于EC 培養(yǎng)基中在44.5 ℃水浴中培養(yǎng)24 h 所觀察到的結(jié)果相一致。這可能與本方法是直接培養(yǎng)有關(guān)，由于培養(yǎng)初期就存在較高溫度的影響，另外IPTG 有抑制繁殖的作用，所以如果測定樣品中的糞大腸菌群的數(shù)量較少時，往往會導致測定結(jié)果偏低，因此在實際操作中可適當延長培養(yǎng)時間，培養(yǎng)結(jié)束后可以短暫冷藏提高測定結(jié)果的準確性。而多管發(fā)酵法分為初發(fā)酵和復發(fā)酵2個階段，初發(fā)酵中適宜的培養(yǎng)溫度有利于糞大腸菌群的繁殖生長，因此在低濃度樣品中的糞大腸菌群的檢測結(jié)果受影響較小。具體結(jié)果見表1。

表1 多個樣品采用2種測定方法的結(jié)果比較

3 結(jié)論

本方法在EC 肉湯培養(yǎng)基中添加X-gal 溶液和IPTG 溶液，利用野生型大腸桿菌擁有乳糖操縱子，能被IPTG 誘導表達β-半乳糖苷酶，這能使生色底物X-gal 變成藍色物質(zhì)，在溫度和藍色物質(zhì)的選擇性篩選下使測定時間縮短了一半，大大減少了人力，提高了測定效率。從陽性菌株和陰性菌株的測定以及實際水樣的實驗結(jié)果來看，直接培養(yǎng)法的專一性和準確性與多管發(fā)酵法基本一致，在實際工作中能滿足地表水的糞大腸菌群的測定。