環(huán)狀RNA hsa_circ_002059在胃癌患者組織與循環(huán)血液中的表達(dá)及意義

李榮，江佳佳,2，錢暉，許文榮,2

(1.江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇省檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇鎮(zhèn)江 212000；2.江蘇大學(xué)澳洋腫瘤研究院，江蘇張家港 215600)

胃癌是我國最常見惡性腫瘤之一，現(xiàn)階段急需發(fā)掘新的生物學(xué)標(biāo)志物并建立方便、微創(chuàng)、靈敏和特異的診斷方法[1]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)狀RNA(circular RNAs，circRNAs)廣泛存在于人體各組織和體液(包括外泌體)中，種類與數(shù)量豐富，具有穩(wěn)定性、物種保守性和組織、時(shí)序、疾病特異性，目前已成為最具前景的分子標(biāo)志物[2]。此外，環(huán)狀RNA在多種疾病尤其是腫瘤中具有重要的調(diào)控作用，可作為miRNA分子海綿，通過堿基配對(duì)吸附miRNA，解除其對(duì)下游靶基因的抑制效應(yīng)，具有作為新型治療靶點(diǎn)的潛在價(jià)值[3]。另有研究表明，環(huán)狀RNA與胃癌進(jìn)展密切相關(guān)，可作為胃癌診療的新分子標(biāo)志物[4]。因此，本研究建立檢測(cè)環(huán)狀RNA hsa_circ_002059表達(dá)的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法，并探討其在胃癌組織與外周循環(huán)血液中表達(dá)的臨床意義。

1 材料和方法

1.1主要試劑及儀器 miRNeasy 組織細(xì)胞RNA提取試劑盒、miRNeasy血漿RNA提取試劑盒(德國Qiagen公司)，HiScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、AceQ定量PCR試劑盒、10×DNA上樣緩沖液、100 bp DNA Marker(南京諾唯贊公司)，ExoQuick血漿外泌體提取試劑(美國SBI公司)。NanoDrop ND-2000微量分光光度計(jì)(美國Thermo公司)，CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)，GenoSens凝膠成像分析儀(上海勤翔儀器公司)。

1.2標(biāo)本來源 收集于2015年4月至2016年11月在鎮(zhèn)江市第一人民醫(yī)院普外科初次確診為原發(fā)性胃癌患者的組織標(biāo)本87例，其中男性63例，女性24例，年齡35～88歲，中位年齡66歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)臨床醫(yī)師確診為原發(fā)性胃癌，組織病理切片經(jīng)病理科醫(yī)師復(fù)核確認(rèn)；(2)患者術(shù)前無放、化療等抗癌治療史。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)排除轉(zhuǎn)移和術(shù)后復(fù)發(fā)腫瘤以及胃良性腫瘤；(2)合并其他良惡性腫瘤；(3)伴有糖尿病、精神疾病、免疫疾病、肝腎功能不全、心衰等。收集于2017年1月至2018年6月在鎮(zhèn)江市第一人民醫(yī)院普外科初次確診為原發(fā)性胃癌術(shù)前患者的外周血樣本62例(其中10例血漿樣本因試驗(yàn)過程中損失，丟失相應(yīng)數(shù)據(jù))，其中男性51例，女性11例，年齡38～85歲，中位年齡68歲。并收集同期年齡、性別匹配的體檢健康者62例，其中男性51例，女性11例，年齡38～85歲，中位年齡68歲。本研究通過江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號(hào)：江大校[2020]161)，各研究對(duì)象均簽署知情同意書。

1.3組織及外周血標(biāo)本采集 取上述經(jīng)外科手術(shù)切除獲取的胃癌患者新鮮胃癌組織和距離腫瘤邊緣5 cm以上的鄰近癌旁組織，置于-80 ℃保存。以EDTA-K2真空抗凝管采集胃癌患者術(shù)前以及體檢健康者體檢時(shí)的空腹靜脈血2 mL，2 h內(nèi)以4 ℃、3 000×g離心10 min分離血漿，以每管250 μL分裝至1.5 mL進(jìn)口Ep管，置于-80 ℃保存。

1.4總RNA提取及cDNA合成 組織樣本采用液氮研磨法破碎，按照miRNeasy組織細(xì)胞RNA提取試劑盒說明書提取組織RNA。血漿樣本置于冰上融化，以4 ℃、3 000×g離心15 min，取上清液，按照miRNeasy血漿RNA提取試劑盒說明書提取血漿RNA。按每250 μL血漿加入63 μL ExoQuick血漿外泌體提取試劑、沉淀獲得血漿外泌體，再按照miRNeasy血漿RNA提取試劑盒說明書提取血漿外泌體RNA。采用NanoDrop ND-2000微量分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度與純度，選取吸光度(A260 nm/A280 nm)比值為1.8～2.0的樣本用于后續(xù)試驗(yàn)，RNA樣本置于-80 ℃保存，避免反復(fù)凍融。按照HiScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并置于-20 ℃保存。

1.5hsa_circ_002059與胃癌相關(guān)分析 登錄circ2Traits數(shù)據(jù)庫(http://gyanxet-bata.com/circdb/)首頁，選擇疾病類型為“胃癌”，預(yù)測(cè)hsa_circ_002059與胃癌有關(guān)的可能性。登錄starBase v2.0數(shù)據(jù)庫(http://starbase.sysu.edu.cn/)首頁，輸入環(huán)狀RNA分子名稱“hsa_circ_002059”，分析hsa_circ_002059與胃癌相關(guān)miRNA的結(jié)合位點(diǎn)。

1.6引物設(shè)計(jì)及實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR擴(kuò)增 參照參考文獻(xiàn)[5]，采用Primer Premier 5.0引物設(shè)計(jì)軟件，并使用NCBI Primer Blast數(shù)據(jù)庫分析設(shè)計(jì)引物，引物由美國Invitrogen公司合成。hsa_circ_002059(circBase ID：hsa_circ_0000140)上游引物序列：5′-CCCGATAACACAAGTGCAGC-3′，下游引物序列：5′-CCTGGACCTTCCACCTTCTC-3′，退火溫度為60 ℃，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為126 bp。內(nèi)參基因β-actin(GeneBank ID：NM_001101.5)上游引物序列：5′-CACGAAACTACCTTCAACTCC-3′，下游引物序列：5′-CATACTCCTGCTTGCTGATC-3′，退火溫度為60 ℃，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為265 bp。采用AceQ定量PCR試劑盒及CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)總體系為20 μL，含cDNA模板2 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.4 μL，2×qPCR SYBR Green Master Mix 10 μL，滅菌蒸餾水7.2 μL。PCR循環(huán)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)；于60 ℃時(shí)采集熒光信號(hào)，使用儀器配套的CFX Manager軟件進(jìn)行熔解曲線分析，并檢測(cè)PCR產(chǎn)物特異性。每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，設(shè)置固定閾值記錄Ct值，取3次PCR結(jié)果計(jì)算平均Ct值，采用相對(duì)定量法(-△Ct法)計(jì)算各樣本hsa_circ_002059的表達(dá)水平，公式：△Ct=Cthsa_circ _002059-Ctβ-actin。PCR產(chǎn)物以15 g/L瓊脂糖凝膠電泳，于EB染料中染色15 min后置于凝膠成像儀中顯像并拍照。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料不符合正態(tài)分布，以中位數(shù)(四分位數(shù))[M(P25，P75)]表示，兩組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，率的比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。以ROC曲線分析評(píng)估hsa_circ_002059對(duì)胃癌的篩查價(jià)值，Kaplan-Meier 聯(lián)合log-rank檢驗(yàn)分析生存時(shí)間。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1hsa_circ_002059與胃癌進(jìn)展的關(guān)系 數(shù)據(jù)庫circ2Traits分析結(jié)果顯示，hsa_circ_002059與胃癌有關(guān)(P=0.000 000 48)。數(shù)據(jù)庫starBase v2.0分析結(jié)果顯示，hsa_circ_002059與9種miRNA(hsa-miR-3118、hsa-miR-134-5p、hsa-miR-485-5p、hsa-miR-7-5p、hsa-miR-138-5p、hsa-miR-149-5p、hsa-miR-296-3p、hsa-miR-1271-5p、hsa-miR-96-5p)具有結(jié)合位點(diǎn)，其中8種miRNA均被報(bào)道參與了調(diào)控胃癌進(jìn)展過程[6-13]。

2.2hsa_circ_002059檢測(cè)的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法評(píng)價(jià) 采用熒光定量RT-PCR檢測(cè)胃癌組織、血漿和血漿外泌體中hsa_circ_002059的結(jié)果顯示，熔解曲線為單峰無雜峰，且擴(kuò)增產(chǎn)物Tm值均一。陰性對(duì)照體系在擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)后仍未檢測(cè)出熒光信號(hào)。瓊脂凝膠電泳顯示擴(kuò)增產(chǎn)物為單一條帶，且分子量符合理論大小。

2.3hsa_circ_002059在胃癌組織中的表達(dá)及臨床價(jià)值 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明，胃癌組織中hsa_circ_002059的表達(dá)水平[-8.60(-10.60，-6.81)]顯著低于癌旁組織[-4.47(-7.15，-3.18)]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(U=1 759.0，P<0.001)。以胃癌組織組為疾病組，以癌旁組織為對(duì)照組，繪制ROC曲線評(píng)估組織hsa_circ_002059對(duì)胃癌篩查效能，結(jié)果表明其ROC曲線下面積(AUCROC)為0.768(95%CI：0.690～0.845)，當(dāng)cut-off值為-5.503時(shí)，其篩查胃癌的敏感性為0.67，特異性為0.92，見圖1A。

以cut-off值為界，將患者分為hsa_circ_002059高表達(dá)組(17例)和低表達(dá)組(70例)。胃癌組織中hsa_circ_002059低表達(dá)與較大的腫瘤體積有關(guān)(χ2=6.183，P=0.013)，見表1。生存曲線分析顯示，低表達(dá)hsa_circ_002059的胃癌患者具有較短的預(yù)后生存時(shí)間的趨勢(shì)(平均生存時(shí)間：27.8個(gè)月vs 33.3個(gè)月)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.618，P=0.203)，見圖1B。

注：A，組織hsa_circ_002059篩查胃癌的ROC曲線；B，組織hsa_circ_002059高表達(dá)組和低表達(dá)組胃癌患者生存率的比較。

表1 胃癌組織中hsa_circ_002059的表達(dá)與患者病理參數(shù)的關(guān)系

2.4hsa_circ_002059在胃癌患者血漿及血漿外泌體中的表達(dá)與分析 熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示，胃癌患者血漿中hsa_circ_002059表達(dá)量[-8.87(-10.51，-7.50)]較體檢健康者[-10.22(-10.72，-8.58)]顯著升高(U=1 011.5，P=0.027)。以胃癌患者為實(shí)驗(yàn)組，體檢健康者為對(duì)照組，以ROC曲線評(píng)估血漿hsa_circ_002059對(duì)胃癌篩查的效能，結(jié)果顯示AUCROC為0.626(95%CI：0.518～0.734)，當(dāng)cut-off值為-9.416時(shí)，其篩查胃癌的敏感性為0.65，特異性為0.64，見圖2A。

以cut-off值為界，將胃癌患者分為hsa_circ_002059高表達(dá)組(33例)和低表達(dá)組(19例)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)胃癌患者血漿中hsa_circ_002059高表達(dá)與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(χ2=12.231，P=0.005)，見表2。生存曲線分析顯示，血漿中高表達(dá)hsa_circ_002059的胃癌患者較低表達(dá)患者的預(yù)后生存時(shí)間顯著縮短(平均生存時(shí)間：34.5個(gè)月vs 45.8個(gè)月)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.594，P=0.032)，見圖2B。熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示，胃癌患者血漿外泌體hsa_circ_002059的表達(dá)水平[-9.84(-11.61，-4.95)]與體檢健康者[-9.84(-10.51，-7.83)]相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(U=1 746.0，P=0.379)。

注：A，血漿hsa_circ_002059篩查胃癌的ROC曲線；B，血漿hsa_circ_002059高表達(dá)組和低表達(dá)組胃癌患者生存率的比較。

表2 胃癌血漿中hsa_circ_002059的表達(dá)與患者組織病理參數(shù)的關(guān)系

3 討論

近年來，許多環(huán)狀RNA被發(fā)現(xiàn)異常表達(dá)于腫瘤中且具有診斷與預(yù)后評(píng)估價(jià)值。如在肝癌組織中呈顯著高表達(dá)的hsa_circ_0128298可用于肝癌的輔助篩查(AUCROC為0.661)與不良預(yù)后的判斷[14]。本研究利用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)確定hsa_circ_002059為胃癌相關(guān)環(huán)狀RNA，對(duì)其設(shè)計(jì)了特異性引物并建立了熒光定量RT-PCR方法，經(jīng)驗(yàn)證該方法可以用于檢測(cè)組織、血漿和外泌體中hsa_circ_002059的表達(dá)水平。

筆者進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，hsa_circ_002059低表達(dá)于胃癌組織(AUCROC達(dá)0.768)，顯著優(yōu)于傳統(tǒng)的胃癌診斷標(biāo)志物CEA、CA19-9、CA72-4(AUCROC分別為0.653、0.639、0.685)[15]，具有胃癌輔助篩查價(jià)值。此外，血漿中高表達(dá)hsa_circ_002059的胃癌患者相較于低表達(dá)患者的平均生存時(shí)間明顯縮短，故而hsa_circ_002059可用于胃癌患者不良預(yù)后評(píng)估。盡管Sun等[16]發(fā)現(xiàn)血漿中顯著低表達(dá)的has_circ_0000520可作為胃癌診斷標(biāo)志物，其診斷效能顯著高于組織樣本檢測(cè)(AUCROC：0.897 vs 0.613)，且循環(huán)血液標(biāo)本獲取僅需微創(chuàng)方法，比組織樣本獲取更具優(yōu)勢(shì)。但本研究發(fā)現(xiàn)，血漿hsa_circ_002059用于胃癌輔助診斷的AUCROC為0.626，但血漿外泌體檢測(cè)未能區(qū)分胃癌患者與體檢健康者，且組織學(xué)檢測(cè)未能區(qū)分預(yù)后不良患者。因此，在輔助診斷中hsa_circ_002059的組織學(xué)檢測(cè)效能優(yōu)于血漿和血漿外泌體檢測(cè)，而在預(yù)后評(píng)估中hsa_circ_002059的血漿檢測(cè)效能則優(yōu)于組織學(xué)檢測(cè)。

此外，環(huán)狀RNA被證實(shí)與miRNA具有結(jié)合位點(diǎn)，可作為miRNA分子海綿，參與胃癌等腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移過程。本研究發(fā)現(xiàn)，hsa_circ_002059具有多個(gè)胃癌相關(guān)miRNA的結(jié)合位點(diǎn)，可能通過miRNA分子海綿參與胃癌進(jìn)展。進(jìn)一步分析結(jié)果顯示，在胃癌組織中低表達(dá)的hsa_circ_002059與腫瘤大小有關(guān)，在胃癌患者血漿中高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示hsa_circ_002059與腫瘤進(jìn)展相關(guān)。該分子在胃癌進(jìn)展過程中的具體作用及機(jī)制有待進(jìn)一步體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)。盡管有研究顯示，環(huán)狀RNA在組織與循環(huán)血液中的表達(dá)水平相一致[17]。但本研究證實(shí)hsa_circ_002059在胃癌組織與血漿中的表達(dá)水平相反，與Lu等[18]報(bào)道的hsa_circ_0006633表達(dá)情況相似，其內(nèi)在的分子機(jī)制有待于進(jìn)一步揭示，可能與環(huán)狀RNA細(xì)胞分泌和清除機(jī)制有關(guān)。

綜上所述，hsa_circ_002059表達(dá)與胃癌進(jìn)展有關(guān)，組織學(xué)和血漿樣本檢測(cè)有望用于胃癌輔助診斷與預(yù)后評(píng)估。在后續(xù)研究中，我們將深入探討其調(diào)控胃癌進(jìn)展的作用和分子機(jī)制，并進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，驗(yàn)證其對(duì)胃癌臨床診療的潛在應(yīng)用價(jià)值。