九龍蟲(chóng)對(duì)衰老小鼠皮膚的影響

熊慧，戢丹菊，楊家林，劉德洪

（鄂州職業(yè)大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北鄂州436099）

隨著機(jī)體衰老，皮膚生理結(jié)構(gòu)出現(xiàn)功能退化現(xiàn)象，本課題組在前期研究中，提示九龍蟲(chóng)具有抗衰老作用[1]，本實(shí)驗(yàn)主要研究九龍蟲(chóng)對(duì)D-半乳糖衰老模型小鼠皮膚組織水分、水通道蛋白3、透明質(zhì)酸、羥脯氨酸、總膠原蛋白、Ⅲ型蛋白的影響。

1 材料與儀器

1.1 動(dòng)物

清潔級(jí)KM 小鼠60 只，體重20±2g，雌雄各半，動(dòng)物合格證號(hào)：42000600015619，許可證號(hào):SCXK(鄂)2015-0018，湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供。

1.2 試劑

D-半乳糖，批號(hào)：20190523，購(gòu)自上海喜潤(rùn)化學(xué)工業(yè)有限公司；九龍蟲(chóng)散，本院自制，用前配成混 懸 液；透 明 質(zhì) 酸 試 劑 盒 （ELISA），批 號(hào)：20200606，購(gòu)自自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；羥脯氨酸試劑盒（ELISA），批號(hào)：20200613，購(gòu)自自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；皮膚Ⅲ型膠原蛋白試劑盒，批號(hào)：20200712，彈性蛋白ELISA 試劑盒，批號(hào)：20200723，水通道蛋白3ELISA 試劑盒，批號(hào)：202006013，購(gòu)自南京建成生物工程研究所；維生素E 膠丸，批號(hào)：20190724，購(gòu)自海南養(yǎng)生堂保健品有限公司。

1.3 儀器

渡揚(yáng)DOR YANG UV759 掃描型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，渡揚(yáng)精密儀器（上海）有限公司；便攜彈性水分油光皮膚測(cè)試儀，韓國(guó)HUNTKEY 公司；高速離心機(jī)，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；9602A 酶標(biāo)儀，南京普朗醫(yī)用設(shè)備有限公司。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組與給藥

適應(yīng)性喂養(yǎng)7 天后，將60 只小鼠隨機(jī)分為6組：分別為九龍蟲(chóng)高、中、低劑量組、維生素E 組、正常組、模型組。造模，九龍蟲(chóng)高、中、低劑量組、維生素E 組和模型組每日注射半乳糖于小鼠頸背皮下，劑量為120mg/kg，一共42 天，致亞急性衰老模型；正常組每日于小鼠頸背皮下注射等量生理鹽水。給藥，造模1 周后，九龍蟲(chóng)高、中、低劑量組分別給予0.040、0.020、0.010g/kg·d 九龍蟲(chóng)混懸液灌胃，維生素E 組灌胃維生E15mg/kg·d，模型組及正常組給予生理鹽水15ml/kg·d 灌胃。最后一次給藥24 小時(shí)后，處死動(dòng)物，立即取樣，檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)：

2.2 皮膚水分檢測(cè)

取適量背部皮膚，用皮膚水分測(cè)定儀采用干燥法檢測(cè)皮膚含水量。皮膚含水百分率=（濕質(zhì)量-干質(zhì)量）/濕質(zhì)量×100%

2.3 皮膚組織透明質(zhì)酸、羥脯氨酸、Ⅲ型膠原蛋白和膠原蛋白檢測(cè)

取背部皮膚約1g，剪碎，加入9 倍生理鹽水，勻漿，2500 r/min 離心10 min，取上清液，按試劑盒說(shuō)明檢測(cè)透明質(zhì)酸、羥脯氨酸、Ⅲ型膠原蛋白和膠原蛋白含量。

2.4 皮膚組織水通道蛋白3 檢測(cè)

取背部皮膚約1cm2，剪碎，按1:9 比例加入生理鹽水，勻漿，2500r/min 離心10min，取上清液1ml，按1∶9 比例用生理鹽水再次勻漿，2500r/min 離心5min，按試劑盒說(shuō)明取上清液檢測(cè)水通道蛋白3 含量。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用spss21.0 軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±S）表示，用T 檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 對(duì)小鼠皮膚水分、水通道蛋白3 的影響

3 含量明顯低于正常組，差異有極顯著意義 （P<0.01）；而九龍蟲(chóng)各劑量組和維生素E 組皮膚含水率、水通道蛋白3 明顯升高（P<0.05 或P<0.01），與模型組比較，提示九龍蟲(chóng)可以明顯改善衰老小鼠皮膚水分和水通道蛋白3 含量。

表1 九龍蟲(chóng)對(duì)衰老模型小鼠皮膚水分、水通道蛋白3 的影響(x±S，n=10)

3.2 對(duì)小鼠皮膚組織透明質(zhì)酸、羥脯氨酸的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，模型組皮膚組織透明質(zhì)酸、羥脯氨酸含量明顯降低（P<0.01）），與正常組比較；與模型組比較，九龍蟲(chóng)各劑量組和維生素E 組皮膚組織透明質(zhì)酸、羥脯氨酸明顯升高（P <0.05 或P<0.01）。見(jiàn)表2。

表2 九龍蟲(chóng)對(duì)衰老模型小鼠皮膚組織透明質(zhì)酸、羥脯氨酸的影響(x±S，n=10)

3.3 對(duì)小鼠皮膚組織Ⅲ型膠原蛋白、膠原蛋白的影響

由表3 可見(jiàn)，與正常組比較，模型組皮膚組織Ⅲ型膠原蛋白、膠原蛋白含量明顯降低，差異有極顯著意義（P<0.01））；與模型組比較，九龍蟲(chóng)各劑量組和維生素E 組Ⅲ型膠原蛋白、膠原蛋白含量明顯升高（P<0.05 或P<0.01），與對(duì)小鼠皮膚組織水分、水通道蛋白3、透明質(zhì)酸、羥脯氨酸的影響基本一致。

表3 九龍蟲(chóng)對(duì)衰老模型小鼠皮膚組織Ⅲ型膠原蛋白、膠原蛋白的影響(x±S，n=10)

4 討論

衰老是一種自然規(guī)律，而衰老過(guò)程中變化最為顯著的器官之一就是皮膚，此過(guò)程中，逐漸出現(xiàn)皮膚組織缺水、表皮和真皮層變薄、皮膚膠原蛋白減少、黑色素沉積，從而使皮膚變得松弛、無(wú)光澤、并產(chǎn)生皺紋、色斑等現(xiàn)象[2]。隨著皮膚衰老，表皮層和真皮層逐漸變薄，皮膚內(nèi)水分也隨之損失，因此，隨著年齡的增長(zhǎng)，皮膚水分含量會(huì)下降[3]，故皮膚含水量可以作為檢測(cè)皮膚衰老指標(biāo)之一；皮膚的水轉(zhuǎn)運(yùn)可影響皮膚含水量，而水轉(zhuǎn)運(yùn)是通過(guò)水通道蛋白來(lái)實(shí)現(xiàn)的，其中水通道蛋白3 對(duì)皮膚水轉(zhuǎn)運(yùn)影響最大，其可以促進(jìn)皮膚細(xì)胞的水合能力，增加皮膚含水率，從而改善皮膚干燥、萎縮、下垂等表現(xiàn)，作為皮膚水轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)鍵蛋白，水通道蛋白3 與皮膚自然衰老密切相關(guān)，可作為抗衰老藥物的作用靶點(diǎn)[4-5]。本試驗(yàn)顯示，九龍蟲(chóng)可明顯提高衰老小鼠皮膚含水量和水通道蛋白3 含量，其中九龍蟲(chóng)高劑量組和中劑量組的改善效果優(yōu)于維生素E 組。

透明質(zhì)酸是一種大量存在于表皮和真皮的結(jié)構(gòu)成分，屬于細(xì)胞外基質(zhì)，是一種非常理想的皮膚保濕劑，因?yàn)槠淇梢钥刂破つw水分平衡，對(duì)皮膚組織有很強(qiáng)的保水作用，從而維持皮膚含水率，延緩皮膚衰老。人體皮膚組織透明質(zhì)酸的含量是隨著年齡的增長(zhǎng)逐漸減少的，也是皮膚衰老的表現(xiàn)之一。因此，透明質(zhì)酸是衡量真皮層保濕能力及皮膚衰老的最佳指標(biāo)之一[6]。本試驗(yàn)顯示，九龍蟲(chóng)可明顯提高衰老小鼠皮膚透明質(zhì)酸含量，結(jié)果與上述皮膚含水量和水通道蛋白3 一致。

膠原蛋白是一種結(jié)構(gòu)蛋白，是皮膚的重要組成成分，真皮層衰老主要原因就是膠原蛋白的減少，真皮層在皮膚的中間，大部分由蛋白質(zhì)構(gòu)成，這部分蛋白質(zhì)主要由膠原蛋白和彈性纖維組成，缺少膠原蛋白就會(huì)造成真皮層萎縮，皮膚下垂長(zhǎng)皺紋，面部衰老。在組成膠原蛋白的所有氨基酸中，其中含量最多、最穩(wěn)定、最重要的是羥脯氨酸。因此，膠原蛋白和羥脯氨酸含量的高低可以判斷出受試動(dòng)物皮膚衰老的程度[7-8]。本試驗(yàn)顯示，九龍蟲(chóng)可明顯提高衰老小鼠皮膚羥脯氨酸、膠原蛋白和Ⅲ型膠原蛋白含量。

九龍蟲(chóng)可以改善皮膚衰老模型小鼠皮膚皮膚含水量、水通道蛋白3、透明質(zhì)酸、羥脯氨酸、膠原蛋白和Ⅲ型膠原蛋白含量，具有一定的體內(nèi)抗皮膚衰老作用。