血清AFP與超聲聯合DNA5-羥基胞嘧啶檢測在原發性肝癌早期篩查中的臨床應用

湯雄　柯云霞　黃潔　方芳　楊高中　袁亮明

【摘要】目的：探究血清甲胎蛋白（Alpha fetoprotein，AFP）與超聲聯合DNA5-羥甲基胞嘧啶（5-hydroxymethylation，5-hmC）在原發性肝癌早期篩查中的臨床應用價值;方法：選擇2019年1月至2019年12月于九江市第三人民醫院接受診治的80例疑似原發性肝癌患者為研究對象，分別對其開展血清AFP、超聲以及5-hmc檢測，以病理學檢測結果為金標準，分別評估3種檢測方式在原發性肝癌早期篩查中的應用價值;結果：血清AFP對原發性肝癌診斷一致性、靈敏度和特異度分別為61.25%、48.84%和70.00%，超聲診斷一致性、靈敏度和特異度分別為56.25%、37.21%和78.38%，5-hmc診斷一致性、靈敏度和特異度分別為83.75%、81.40%和86.49%;3種檢測方式聯合檢測對原發性肝癌診斷一致性、靈敏度和特異度分別為95.00%、97.67%、91.89%，相較其他聯合檢測三種方式聯合診斷價值最高（P<0.05）;結論：血清AFP、超聲和5-hmc檢測應用于原發性肝癌早期篩查中，可以提高早期肝癌的發現率。

【關鍵詞】血清AFP;超聲;5-hmc;原發性肝癌;早期篩查;臨床應用

【中圖分類號】R735.7 【文獻標識碼】A 【DOI】

【基金項目】血清AFP與超聲聯合DNA5-羥基胞嘧啶檢測在原發性肝癌早期篩查中的臨床應用;（編號：20191108;合同編號：20202042）

肝細胞癌（HCC）目前是我國死亡率位居第二的惡性腫瘤，HCC在慢性肝病及肝硬化患者中呈現發病率高、惡性程度高等相關特征，70%以上肝癌患者被確診已到中晚期，因此早期的篩查和診斷顯得尤為關鍵[1]。目前臨床常用篩查方法為AFP和超聲，已有的研究證實約有30%的肝癌患者AFP為陰性[2]，而超聲檢測在≤2cm的肝臟腫瘤的靈敏度只有20%[3]。近年來，表觀遺傳修飾5hmc（5-羥甲基胞嘧啶）的高通量檢測作為新型、高效的肝癌篩查手段，能夠從肝癌形成的源頭切入檢測，更早更準發現肝癌，其靈敏度和特異性均高達90%。可以作為一種早期的篩查分子[3]。本研究擬通過納入80例疑似肝癌患者并分別分析血清AFP、超聲、5hmc對原發性肝癌診斷價值的方式，進一步論證將上述檢測手段聯合應用于原發性肝癌鑒別中的臨床意義，以期為原發性肝癌患者的早期診斷與預后改善提供臨床參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2019年1月至2019年12月于我院接受診治的80例疑似原發性肝癌患者為研究對象。

入組標準：HBV病毒攜帶者有以下任何一項：（1）>40歲的男性，>50歲的女性;（2）肝硬化患者;（3）有肝癌家族史者;（4）其他無肝硬化的HBV病毒攜帶者，根據肝炎活動嚴重程度來判斷是否屬于高危人群。

排除標準：（1）合并有肝臟腫瘤;（2）有不穩定性心絞痛、癥狀性充血性心衰、嚴重的心律失常、過去6個月有心梗、QT間期延長（>450ms）;（3）最近5年之內出現其他部位的惡性腫瘤;（4）患者不能接受隨訪或正參加其它臨床試驗。

1.2 干預方法

1.2.1血清AFP檢測

抽取靜脈血3ml，置一次性采血管內，充分離心，不應有溶血及細胞顆粒，吸取血清0.2ml至專用杯中并放入DXI800發光儀進行檢測。

1.2.2超聲檢查

所有患者在進行超聲檢查前8～12h內禁食、禁水。檢查時，患者先采取仰臥位，平穩呼吸，兩手上舉置于枕后，然后采取側臥位或坐位。根據患者實際情況，將儀器調整至最佳狀況，先進行常規肝臟掃查，觀察左右肝葉的形態改變情況，包膜光滑程度，肝實質回聲增粗、粗糙和分布均勻程度，尋找病灶。

1.2.3Nano 5HmC-Seal技術

（1）游離DNA提取：按照Quick-cfDNA Serum&Plasma Kit （Zymo）產品說明書從血漿中提取cfDNA，cfDNA樣本需要進行回收率質控和污染質控。

（2）添加接頭：修復cfDNA或片段化的基因組DNA并與銜接子連接。

（3）5hmC標記：使用T4噬菌體酶β-GT將含有疊氮基的工程化葡萄糖部分轉移至雙鏈體DNA中的5hmC。

（4）點擊化學反應：使用Huisgen Cycloaddition（點擊）化學，將生物素標簽安裝在疊氮基上。

（5）磁珠捕獲：具有生物素標簽的含5hmC的DNA片段被抗生素蛋白珠有效捕獲。

（6）PCR擴增和二代測序：常規PCR擴增產生文庫，將獲得的測序文庫通過qPCR進行濃度測定，并用Agilent2100對文庫中DNA片段大小含量進行確定。將通過質檢的測序文庫以相同濃度混合，用Illumina測序儀進行測序。測序原始數據Raw Data經得到的clean reads，作為后續分析的基礎。通過計算每個基因的reads數。通過對數據質量評估，包括對測序錯誤率、數據量等進行統計，評估建庫測序是否達到標準，符合標準的數據冊進行后續的分析。

（7）確定各基因標志物的5hmC含量，將獲得的測序結果進行初步質控評估，將達到測序質量標準的獨段利用Bowtie2工具與人類標準基因組參考序列進行比較，繼而確定各基因5hmC含量。

1.3 觀察指標及評測標準

正常人血清AFP濃度<20ng/ml，本研究以血清AFP濃度≥20ng/

ml為陽性;超聲檢測以發現病灶為陽性;以5-mhc≥5.29%為陽性[9]。

1.4 統計學方法

應用SPSS13.0統計軟件進行，計量資料以（均值±標準差）或中位數、四分位間距分布表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗;計數資料用百分比（%）表示，采用卡方檢驗（X 2）。取P<0.05時差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 血清AFP、超聲及5-hmc對原發性肝癌診斷價值分析

以病理學檢測結果為金標準，評估血清AFP對原發性肝癌診斷價值顯示，診斷一致性為61.25%，診斷靈敏度為48.84%，診斷特異度為70.00%，見表1。以病理學檢測結果為金標準，超聲對原發性肝癌診斷一致性為56.25%，診斷靈敏度為37.21%，診斷特異度為78.38%，見表2。以病理學檢測結果為金標準，5-hmc對原發性肝癌診斷一致性為83.75%，診斷靈敏度為81.40%，診斷特異度為86.49%，見表3。

2.2 聯合檢測對原發性肝癌診斷價值分析

分別將血清AFP、超聲以及5-hmc檢測結果進行檢測分析，同樣以病理學結果為金標準，評估顯示3種檢測方式聯合檢測臨床價值最優，其診斷一致性為95.00%，診斷靈敏度為97.67%，診斷特異度為91.89%，相較其他聯合檢測三種方式聯合診斷價值最高（P<0.05），見表4。

3 討論

一項調研指出，國內現有肝癌例數約35萬，占同期癌癥發病例數的11.6%左右[4]。肝癌的確切分子機制目前尚不清晰，但多數研究指出病毒感染、飲水污染、酒精、肝硬化等都與肝癌的發生發展存在密切聯系。DNA羥甲基化修飾是指10-11易位（ten-eleven translocation，TET）蛋白家族通過氧化5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，5-mc）生成5-羥甲基胞嘧啶（5-hydroxymethylation，5-hmc），使基因甲基化狀態終止[5]。本研究通過將80例疑似肝癌患者納入研究并分別實施血清AFP、超聲以及5-hmc檢測的方式，就上述3種措施聯合檢測對原發性肝癌診斷價值進行了分析，結果顯示，單純血清AFP對原發性肝癌診斷一致性、靈敏度和特異度分別為61.25%、48.84%和70.00%，超聲診斷一致性、靈敏度和特異度分別為56.25%、37.21%和78.38%，5-hmc診斷一致性、靈敏度和特異度分別為83.75%、81.40%和86.49%。將血清AFP、超聲以及5-hmc聯合檢測后再次分析顯示，聯合檢測一致性、靈敏度和特異度分別為95.00%、97.67%、91.89%，同任一單純檢測方式相比較，3種方式聯合檢測的臨床價值顯著更優。國內楊國華[6]的研究顯示，TET家族可以催化5mc出現連續氧化反應，通過羥化形成5hmc，而該過程可以轉化胞嘧啶，進而實現DNA的去甲基化，這也是誘發細胞惡變的重要原因之一。

本文作者分析認為，5hmC是5mC主動去甲基化過程中的重要中間產物，被稱為“第六種DNA堿基”，5hmC參與肝癌的發生發展過程，能夠實時動態地反映癌癥相關的基因表達活性，盡管肝癌早期或極早期腫瘤組織釋放入血的循環腫瘤DNA量很低，但5hmC化學標記捕獲技術在循環腫瘤DNA低至1ng情況下仍有穩定的檢測結果，本研究通過聯合血清AFP、超聲以及5hmc的方式，為原發性肝癌的診治提供了新的思路舉措，可以篩查和診斷早期的肝癌患者，為提高患者的生存期打下良好基礎。

綜上所述，血清AFP、超聲和5-hmc檢測應用于原發性肝癌早期篩查中，可以提高早期肝癌的發現率。

參考文獻：

[1]李治軍，紀永利.超聲造影在診斷慢性肝炎背景下直徑≤2cm肝局灶性病變中的應用[J].肝臟，2018，23（11）：97-98.

[2]文天夫.原發性肝癌診療規范（2017年版）解讀[J].中國普外基礎與臨床雜志，2018，25（1）：32-34.

[3]王雙佳，李秀東，蘇旭，等.原發性肝癌患者術后肝外轉移復發分析[J].中華肝膽外科雜志，2018，24（5）：341-343.

[4]趙穎，孟成立.超聲造影診斷原發性肝癌的價值和增強CT對比觀察[J].中國CT和MRI雜志，2021，19（1）：129-131.

[5]汪鑫，閆亮亮，王興宇，等.通過目標區域DNA甲基化測序對隱源性肝癌差異性DNA甲基化譜的研究[J].肝膽外科雜志，2020，28（2）：149-153.

[6]楊國華.TET2/E-cadherin/β-catenin調控環路在肝癌演進中的作用研究[D].南方醫科大學，2018.

作者簡介：

湯雄（1964.11.11-），男，漢族，江西，主任醫師，科主任，本科，研究方向：肝病臨床和基礎研究。