基于SodC單克隆抗體的胞內勞森菌IPMA抗原檢測方法的建立及應用

李敏雪，李劍男，周紅，肖寧，藺輝星，馬喆，范紅結，2

基于SodC單克隆抗體的胞內勞森菌IPMA抗原檢測方法的建立及應用

李敏雪1，李劍男1，周紅1，肖寧1，藺輝星1，馬喆1，范紅結1，2*

1南京農業大學動物醫學院，南京 210095；2江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協同創新中心，揚州大學，江蘇揚州 225009

【目的】胞內勞森菌（，LI）是引起豬增生性腸炎（porcine proliferative enteritis， PPE）的腸道病原菌，主要表現為動物福利下降，給世界養豬業造成嚴重的經濟損失。研究通過制備鼠抗LISodC的單克隆抗體，建立一種針對LI的免疫過氧化物酶細胞單層試驗（IPMA）抗原檢測方法，檢驗其在臨床上的應用性，從而為LI的病原診斷提供一種科學有效的手段。【方法】選取胞內勞森菌弱毒疫苗為研究對象，通過PCR擴增其片段，將其克隆至原核表達載體pGex-6p-1上，成功構建出pGex-6p-1-重組質粒，誘導表達重組蛋白SodC。Western Blot分析重組蛋白的反應原性，一抗使用鼠抗GST標簽的抗體。以該重組蛋白為免疫原，免疫4—6周齡BALB/c小鼠，利用常規細胞融合技術、有限稀釋法和間接ELISA技術篩選陽性雜交瘤細胞，并制備腹水。通過間接免疫熒光（IFA）鑒定該單抗的特異性。以該單抗為一抗，摸索并建立了LI IPMA抗原檢測方法，并評價該方法的特異性、敏感性和重復性。用優化后的IPMA方法對來自江蘇周邊地區豬場回腸組織樣品進行檢測，評價該方法的臨床價值?！窘Y果】純化后SodC蛋白濃度較高，與鼠抗GST標簽的抗體發生特異性結合，表明該蛋白反應原性較好。經3次亞克隆后最終共篩選獲得2株陽性雜交瘤細胞，分別命名為1D6和1F7。單抗亞型鑒定結果顯示：1D6亞型為IgA，1F7亞型為IgG3；ELISA檢測1D6單抗效價為1﹕1 024 000；1F7單抗效價為1﹕1 024 000；間接免疫熒光（IFA）結果表明2株單抗均與LI菌株發生特異性反應，與豬霍亂沙門氏菌（,）、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）和豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）等豬常見病原無交叉反應。優化后IPMA反應條件為：一抗稀釋倍數為1﹕800，作用45min；二抗稀釋倍數為1﹕2 500，作用1h，此時IPMA檢測效果最佳。用該方法檢測、PEDV、TGEV、偽狂犬病毒（PRV）、豬圓環病毒2（PCV2）均為陰性；最低檢測限為103個/mL，說明該方法特異性強、敏感性高。臨床樣品檢測結果顯示146份病料中共檢測出92份陽性樣品，3個不同豬場的陽性樣品檢出率分別為65.6%、68.2%和53.7%，總體陽性率為63.0%。普通PCR方法檢測出82份陽性樣品，兩種方法的陽性符合率為94.6%。【結論】成功制備了鼠抗LI SodC蛋白的單克隆抗體，建立了針對LI抗原的IPMA檢測方法，并對臨床樣品進行了檢測。該方法具有良好的特異性和敏感性，并具有一定的臨床價值，為實驗室LI的分離鑒定、在感染細胞中的定位以及流行病學調查和相關檢疫提供一種有效的技術手段。

胞內勞森菌；SodC蛋白；單克隆抗體；免疫過氧化物酶細胞單層試驗

0 引言

【研究意義】胞內勞森菌（, LI）是引起豬增生性回腸炎（porcine proliferative enteritis, PPE）的一種專性細胞內寄生菌[1-3]。該菌主要感染保育豬且寄生在回腸末端，臨床上以細胞增生和黏膜增厚為主要特征[4]。感染胞內勞森菌的豬表現為生長遲緩、飼料轉化率低，嚴重影響了豬的經濟價值和動物福利，給世界養豬業造成重大經濟損失[3,5-10]。在豬群中，PPE主要呈現增生性出血性腸病(PHE)和豬腸道腺瘤病(PIA)兩種形式。PHE常以散發形式出現，其臨床癥狀和嚴重程度與動物年齡有關[11]；而PIA是PPE臨床上最常見的一種形式，以生長緩慢為主要特征[12-14]。該病于1931年首次報道，廣泛見于歐洲、北美及亞洲的一些豬場，呈世界范圍內流行[15-16]。近年來，我國集約化豬場中該病的發生率呈不斷升高趨勢,普遍存在亞臨床型感染。郭建超等[17]采集廣東不同地區、不同日齡的577份豬糞便樣品進行流行病學調查，結果顯示總體陽性率為16.29%；曲向陽等[18]調查華東地區三省一市規?；i場的PPE感染情況，發現所檢測糞便樣品的總體陽性率達59.81%；黃忠等[19]采用ELISA方法對華南5省區的22個豬場的1 100份豬血清進行檢測，發現22個豬場抗體檢測結果均為陽性。SodC蛋白是抗氧化系統的主要成員。研究顯示SodC是布魯氏菌重要的毒力因子，影響該菌的胞內存活，能夠保護細菌免受過氧化氫的損傷，亦為重要的保護性抗原[20]。研究表明，感染LI的腸上皮細胞對Cu提取轉運蛋白的激活與胞內勞森菌內Zn/Cu-SOD的高表達有關，表明LI通過吸收胞漿內的Cu，表達SodC，逃避宿主細胞中超氧基團的損傷[21]。胞內勞森菌是嚴格胞內寄生菌，目前無法在培養基中進行培養，需要依賴細胞進行細菌培養[22]，檢測出細胞內LI是該菌成功分離與培養的前提?！厩叭搜芯窟M展】目前，已報道建立了PCR、qPCR、LAMP等方法檢測該菌。孫娜等[23]根據16SrRNA建立PCR檢測方法，檢測限為32.8μg·L-1；彭忠等[24]建立了巢式PCR方法，從糞便中檢測該菌的最低限為2.2×102拷貝/μL；PEDERSEN等[25]建立了qPCR方法，能對LI進行定量分析；LI等[26]建立了LAMP方法，可以用于豬糞便中的LI檢測。但PCR僅用于感染排菌期豬糞便樣品檢測，檢測陰性并不能說明未感染。此外，糞便中存在PCR抑制因子，可造成假陰性，且不適合大批樣品的檢測[27-30]?！颈狙芯壳腥朦c】LI可感染特定細胞系，如IPEC-J2、PK-15、McCoy等。臨床上從病料中分離該菌常用小鼠腸上皮細胞McCoy，因此可用IPMA對McCoy中分離的細菌進行檢測。與PCR、IFA等檢測方法相比，IPMA特異性好，敏感性高，操作簡便，判斷直觀，結果可以長期保存[31-36]。同時適合大量樣品篩查，特別是臨床上大規模分離、鑒定該菌。目前國內外建立的IPMA方法均用于PPE的血清流行病學調查，未有針對LI抗原IPMA方法的報道?！緮M解決的關鍵問題】LI特殊的培養特性給該菌的分離、培養帶來一定的困難。目前國內對其臨床感染情況的相關研究報道還很少，仍處于初級階段，研究LI的病原檢測方法對于防治PPE顯得尤為重要。本試驗基于制備的SodC特異性單克隆抗體，建立了一種針對LI的IPMA檢測方法，可用于LI的實驗室和臨床檢測。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

胞內勞森菌疫苗株（B3903），購于Boehringer Ingelheim公司；SPF級BALB/c小鼠購自青龍山動物繁殖場；McCoy細胞購自ATCC；HRP標記的羊抗鼠IgG購自北京博奧森生物科技有限公司；小鼠單克隆抗體亞型鑒定試劑盒購自南京迅貝生物科技有限公司；3-氨基-9-乙基咪唑（AEC）顯色劑試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司；二氨基聯苯胺（DAB）顯色液購自凱基生物技術股份有限公司。

1.2 試驗時間及地點

試驗于2019年3—6月在南京農業大學實驗動物中心進行。

1.3 SodC蛋白的原核表達及純化

以豬胞內勞森菌弱毒疫苗為模板，常規PCR擴增片段，鑒定為陽性后切膠回收片段。以pGex-6p-1為載體，酶切并連接pGex-6p-1和上述PCR擴增產物，構建pGex-6p-1-重組質粒。連接產物熱激轉化至感受態DH5ɑ，PCR鑒定為陽性的菌液提質粒轉化BL21感受態，含有重組質粒的BL21命名為pGex-6p-1-/BL21。

將重組菌pGex-6p-1-/BL21接種到含氨芐青霉素和氯霉素的LB液體培養基中，置于37℃、180 r/min震蕩培養至OD600nm為0.6—0.8時，加入終濃度0.5 mmol·L-1IPTG，于16℃、90 r/min誘導18 h，離心收集菌體，超聲破碎后進行SDS - PAGE電泳鑒定。

1.4 重組SodC蛋白的Western Blot 分析

純化后的SodC蛋白經SDS-PAGE電泳后，Western Blot分析該單抗與蛋白的反應原性。一抗使用鼠抗GST標簽的抗體，顯色液使用二氨基聯苯胺（DAB）顯色液。

1.5 鼠抗SodC蛋白單抗的制備

使用GST親和層析柱對重組SodC進行純化。純化后SodC蛋白免疫4—6周齡BALB/c小鼠，采用皮下多點注射方式，免疫劑量為50 μg/只。一免后第14和21天各加強免疫一次，免疫劑量與免疫途徑同首免。三免后7 d選取效價最高的小鼠進行沖擊免疫，采用腹腔注射的方式，免疫劑量為100μg/只，沖擊免疫后3 d取小鼠脾細胞與SP2/0細胞進行融合。以間接ELISA篩選陽性雜交瘤細胞，經3—5次亞克隆后獲得穩定分泌抗體的雜交瘤細胞株。以1×106個/只的數量注射小鼠腹腔，制備腹水單抗，檢測效價。

1.6 SodC蛋白單克隆抗體的鑒定

1.6.1 單克隆抗體亞型鑒定 用小鼠單抗亞型鑒定試劑盒進行亞型鑒定，操作按說明書進行。

1.6.2 單克隆抗體特異性鑒定 采用常規間接免疫熒光（IFA）鑒定單抗與LI反應的特異性，陰性對照孔用，PEDV，TGEV感染細胞。

1.7 IPMA檢測方法的建立

1.7.1 IPMA檢測反應板的制備

（1）將McCoy細胞從液氮中取出復蘇，加入含10%胎牛血清的DMEM培養基中，置于37℃，5% CO2溫箱中培養，傳代5次后即可使用。將生長狀態良好的McCoy細胞接種于96孔細胞培養板內，消化后調整細胞密度為1×104—1×105個/mL，置于37℃、5% CO2培養箱培養24 h；

（2）形成單層細胞后，加入稀釋后的豬LI弱毒疫苗，菌量為103.9TCID50/mL，陰性對照孔加入等量的DMEM培養液，細胞培養板室溫2 000×離心10—15 min，置于含8.0%O2、8.8%CO2和83.2%N2的環境三氣培養箱中培養3 h；

（3）更換培養液為含萬古霉素（100 μg·mL-1）、新霉素（50 μg·mL-1）和兩性霉素B（2 μg·mL-1）的培養液，置于三氣培養箱中培養至24 h；

（4）加入0.1% PBS稀釋的Triton X-100，室溫透化10 min；

（5）加入4%多聚甲醛在室溫固定15 min，干燥后于4℃保存備用。

1.7.2 IPMA檢測步驟 取出IPMA反應板于室溫預熱，按1﹕800比例加入SodC腹水單抗，37℃孵育1 h；按1﹕2 500比例加入HRP標記羊抗鼠IgG，37℃孵育1 h；加入AEC底物，室溫顯色20 min，甩去底物，加入PBS終止反應，加入蘇木素染液染色30 s，徹底干燥后用光學顯微鏡觀察結果。每個步驟之間需用PBS清洗3次。陽性判定標準：SodC單抗與感染細胞的細菌反應,胞核呈藍色，胞漿呈棕紅色；陰性判定標準：SodC單抗與健康細胞不反應，胞核呈藍色，胞漿不著色。

1.8 IPMA反應條件的確定

1.8.1 一抗及二抗工作濃度的測定 制備IPMA反應板，將一抗分別進行1﹕50、1﹕100、1﹕200、1﹕400、1﹕600、1﹕800、1﹕1 000、1﹕2 000稀釋，按照IPMA操作程序，分別加入1﹕500、1﹕1 000、1﹕2 500、1﹕3 000、1﹕4 000、1﹕5 000、1﹕6 000稀釋的二抗，進行IPMA檢測，確定一抗及二抗的最佳稀釋度。

1.8.2 一抗最佳孵育時間的確定 制備IPMA反應板，加入最佳工作濃度一抗，于37℃作用30、45、60、90、120 min，進行IPMA操作，確定一抗最佳孵育時間。

1.8.3 二抗最佳孵育時間的確定 制備IPMA反應板5塊，將二抗稀釋到最佳工作濃度，分別于37℃作用30、45、60、90、120 min，按照IPMA操作程序，確定二抗最佳孵育時間。

1.8.4 IPMA方法的特異性、敏感性和重復性試驗 用，PEDV，TGEV，PCV2分別進行IPMA檢測，確定其特異性；將胞內勞森菌培養物稀釋為1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101個菌，進行IPMA檢測，確定其最低檢測限；取不同批次和相同批次制備的IPMA反應板進行3次重復試驗，比較檢測結果的重復性。

1.8.5 IPMA對臨床樣品的檢測 分別從江蘇3個不同地區豬場采集146份豬回腸組織樣品，用優化后的IPMA對臨床樣品進行檢測。

2 結果

2.1 SodC蛋白表達與純化

SDS - PAGE電泳結果（圖1）顯示，在40 kD左右可見一條蛋白條帶，與目的蛋白大小一致，表達量高，主要以上清形式表達。純化后的蛋白濃度達1.02 mg·mL-1,純度較高，可作為免疫原免疫動物。

M：蛋白分子量標準；1：pGex-6p-1空載體質粒；2：未誘導的重組表達質粒；3：誘導表達后的全菌液；4：誘導表達后的上清；5：誘導表達后的包涵體；6：純化后的SodC蛋白

2.2 單克隆抗體的Western Blot分析

采用Western Blot方法檢測SodC蛋白的反應原性。結果顯示，SodC蛋白與一抗抗發生了特異性結合，在40 kD處出現一條明顯的單一蛋白條帶（圖2），結果與預期大小相符，進一步證明該蛋白在原核載體中成功表達，并具有良好的抗原性。

M：預染蛋白質分子質量標準；1：SodC純化蛋白；2：空白對照

2.3 單克隆抗體效價測定

經篩選獲得1D6和1F7這2株陽性雜交瘤細胞。免疫小鼠制備腹水，間接ELISA檢測結果顯示，1D6單抗效價為1﹕1 024 000，1F7單抗效價為1﹕1 024 000。

2.4 單克隆抗體亞型鑒定

經過亞型鑒定，1D6、1F7單抗重鏈亞型分別為IgA鏈、IgG3鏈，2株單抗輕鏈均為κ鏈。

2.5 單克隆抗體特異性鑒定

IFA結果顯示，2株單抗均能與LI發生反應，胞核呈藍色，胞漿內產生綠色熒光，而與.、PEDV、TGEV無特異性反應（圖3）。

A：1D6與LI感染細胞反應；B：1F7與LI感染細反應；C-E：單抗分別與S.Cholerasuis、PEDV、TGEV反應；F：陰性對照

2.6 IPMA反應條件的確定

經優化后最終確定IPMA反應條件為：一抗稀釋濃度1﹕800，作用45min；二抗稀釋濃度為1﹕2 500，作用1h時，此時IPMA顯色效果最佳（圖4、5）。

A：單抗與LI感染細胞反應；B：單抗與健康細胞反應

A：單抗與LI感染細胞反應；B：單抗與健康細胞反應

2.7 IPMA的特異性

IPMA方法除了與LI發生特異性反應外，與PEDV、TGEV、PCV2、PRV均無交叉反應，表明建立的IPMA方法具有良好的特異性（圖6）。

2.8 IPMA的敏感性

將LI以1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101個/mL共6個梯度胞內勞森菌感染細胞，經IPMA檢測，發現當細菌濃度稀釋至為103個/mL時，鏡下可見較少的棕紅色反應，而當細菌濃度稀釋至為102個/mL時，未見棕紅色反應，說明該方法最低檢測限為103個/mL（圖7）。

A：單抗與LI感染細胞反應；B-F：單抗分別S.Cholerasuis、PEDV、TGEV、PCV2 、PRV感染細胞反應

2.9 IPMA的重復性

通過檢測IPMA 96孔檢測板的批間和批內重復性，3次檢測結果顯示，IPMA反應板批間與批內檢測結果一致,重復性良好。

2.10 IPMA對臨床樣品的檢測

用優化后的IPMA方法對豬回腸組織樣品進行檢測，146份病料中共檢測出92份陽性樣品，3個不同地區屠宰場的陽性樣品檢出率分別為65.6%、68.2%和53.7%，總體陽性率為63.0%。普通PCR方法檢測出82份陽性樣品，兩種方法的陽性符合率為94.6%，陰性符合率為91.5%。（表1）

A-F：單抗分別與1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101個/mL LI感染細胞反應

表1 IPMA對臨床樣品的檢測

3 討論

LI主要感染動物回腸末端，嚴重時可擴展至整個腸道[3]。該菌主要定植于未成熟的腸隱窩上皮細胞中，造成腺瘤樣增生、黏膜增厚、出血性炎癥等臨床癥狀[37-38]。近年來，隨著我國生豬養殖規?；潭仍絹碓礁?，大部分豬場存在LI感染。目前國內對LI的流行現狀和致病機理等方面的研究仍處于初級階段，鑒于該病給我國養殖業造成的巨大經濟損失，LI病原診斷與檢測受到廣泛關注。LI是嚴格細胞內寄生菌，但體外可感染IEC-18、IPEC-J2、PK-15、McCoy等細胞，并在這些細胞系上生長增殖[39-43]。迄今為止，只有McCoy細胞被系統地評估了LI誘導的增殖，因此可用IPMA方法對LI進行檢測。

近年來，國內外相繼建立了LI IPMA抗體檢測方法，擬用于增生性腸炎的血清流行病學調查，但敏感性存在不足[34,44]。本研究基于SodC單克隆抗體，首次建立了檢測LI的IPMA方法。通過優化，確定一抗最佳稀釋度為1﹕800，作用45 min；二抗最佳稀釋度為1﹕2 500，作用1 h，檢測效果最佳。該單抗僅與LI發生特異性反應，與表達的以及其他常見腸道病原，如PEDV、TGEV、PRV、PCV2均無交叉反應，進一步說明該方法特異性強。此外，該方法具有較高的敏感性，其最低檢測限為103個/mL。常規PCR雖可以對細胞內LI進行鑒定，但是細胞中基因組提取的純度會直接影響后續酶解和PCR反應，導致假陰性。IFA雖然也可以檢測細胞內的LI，但是對儀器設備要求較高，檢測結果不能長時間保存。且IFA二抗為熒光抗體，假陽性結果的可能性增大；而IPMA檢測僅需要光學顯微鏡可以進行亞細胞定位，肉眼即可判定陽性結果，顯色板可保存幾個月。

在LI IPMA抗原檢測方法成功建立的基礎上，本試驗對3個不同地區豬場的146份回腸組織病料進行檢測，共檢測出92份陽性樣品，總體陽性率為63.0%；而常規PCR陽性檢出率為56.2%，敏感性低于IPMA抗原檢測方法，可能的原因是模板基因組裂解過程中多種因素影響了PCR反應，從而降低了檢測的敏感性。本文建立的IPMA檢測方法，當樣品中細菌含量低于103個/mL時，亦不能發生特異性的顯色反應。但是，實驗室用McCoy分離臨床LI樣品時，初傳陽性樣本細胞LI的量可達到1×103至1×104個/mL，所以本研究建立的IPMA檢測方法可用于實驗室LI的檢測。

4 結論

本研究基于SodC單克隆抗體成功建立了胞內勞森菌IPMA抗原檢測方法，該方法具有較高的特異性、敏感性和重復性，適用于實驗室胞內勞森菌的分離鑒定以及臨床樣品的快速檢測。

[1] 尹會方, 楊小燕, 張新平, 鄭新添, 林志, 黃偉彬.豬腸道粘膜胞內勞森氏菌的分離與檢測.龍巖學院學報, 2012, 30(5): 55-60.

YIN H F, YANG X Y, ZHANG X P, ZHENG X T, LIN Z, HUANG W B.Isolation and detection ofof porcine intestinal mucosa.Journal of Longyan Univercity, 2012, 30(5): 55-60.(in Chinese)

[2] STEGE H, JENSEN T K, M?LLER K, VESTERGAARD K, BAEKBO P, JORSAL S E.Infection dynamics ofin pig herds.Veterinary Microbiology, 2004, 104(3/4): 197-206.

[3] LOUBLIER C, CERRI S, GRYSPEERDT A, AMORY H, BAUWENS C, CESARINI C.High seroprevalence againstamong adult horses in Belgium.Journal of Equine Veterinary Science, 2020, 95: 103304.

[4] 佟曉宇.豬回腸炎的流行病學、臨床癥狀和防治措施.現代畜牧科技, 2019(5): 90-91.

TONG X Y.Epidemiology, clinical symptoms and control measures of ileitis in pigs.Modern Animal Husbandry Science & Technology, 2019(5): 90-91.(in Chinese)

[5] MCORIST S, MACINTYRE N, STOKES C R, LAWSON G H.Immunocytological responses in porcine proliferative enteropathies.Infection and Immunity, 1992, 60(10): 4184-4191.

[6] LAWSON G H K, GEBHART C J.Proliferative enteropathy.Journal of Comparative Pathology, 2000, 122(2-3):77-100.

[7] KINOSHITA Y, NIWA H, UCHIDA-FUJII E, NUKADA T.Genotyping of equinesampled in Japan by using multilocus variable-number tandem repeat analysis.Journal of Equine Veterinary Science, 2021, 96: 103311.

[8] JACOBSON M, FELLSTR?M C, JENSEN-WAERN M.Porcine proliferative enteropathy: an important disease with questions remaining to be solved.Veterinary Journal, 2010, 184(3): 264-268.

[9] 余彥國, 張瑾.豬增生性腸炎的研究進展.畜牧獸醫雜志, 2009, 28(3): 33-36.

YU Y G, ZHANG J.Research advance in porcine proliferative enteritis.Journal of Animal Sciaence and Veterinary Medicine, 2009, 28(3): 33-36.(in Chinese)

[10] 劉佩紅, 王建, 張維誼.豬增生性腸炎的病原特性研究進展.上海畜牧獸醫通訊, 2005(1): 12-13.

LIU P H, WANG J, ZHANG W Y.Advances in pathogenic characteristics of porcine proliferative enteritis.Shanghai Journal of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, 2005(1): 12-13.(in Chinese)

[11] VISSCHER C, KRUSE A, SANDER S, KELLER C, MISCHOK J, TABELING R, HENNE H, DEITMER R, KAMPHUES J.Experimental studies on effects of diet oninfections in fattening boars in a natural infection model.Acta Veterinaria Scandinavica, 2018, 60(1): 22.

[12] LEITE F L, ABRAHANTE J E, VASQUEZ E, VANNUCCI F, GEBHART C J, WINKELMAN N, MUELLER A, TORRISON J, RAMBO Z, ISAACSON R E.A cell proliferation and inflammatory signature is induced byinfection in swine.bioRxiv, 2018, DOI:10.1101/384230.

[13] WATTANAPHANSAK S, GEBHART C, OLIN M, DEEN J.Measurement of the viability ofs.Canadian Journal of Veterinary Research-revue Canadienne De Recherche Veterinaire, 2005, 69(4):265-271.

[14] OBRADOVIC M R, WILSON H L.Immune response and protection againstinfections in pigs.Veterinary Immunology and Immunopathology, 2020, 219: 109959.

[15] 吳艷陽, 楊東東, 高冬生, 李永濤, 常洪濤, 王川慶, 趙軍.胞內勞森菌LsaA蛋白的原核表達及間接ELISA抗體檢測方法的建立.畜牧獸醫學報, 2018, 49(4): 786-793.

WU Y Y, YANG D D, GAO D S, LI Y T, CHANG H T, WANG C Q, ZHAO J.Prokaryotic expression of LsaA protein ofand development of a LsaA-based indirect ELISA for antibody detection.Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2018, 49(4): 786-793.(in Chinese)

[16] BIESTER H E, SCHWERTE L H.Intestinal adenoma in swine.American Journal of Pathology，1931, 7:175-185.

[17] 郭建超, 覃宗華, 張巖毅, 蒲文珺, 任邵娜, 張浩吉, 馬春全, 李國清, 白挨泉.豬增生性腸炎PCR診斷方法的建立及臨床樣品檢測.動物醫學進展, 2014, 35(4): 89-93.

GUO J C, QIN Z H, ZHANG Y Y, PU W J, REN S N, ZHANG H J, MA C Q, LI G Q, BAI A Q.Development of PCR diagnostic method and clinical sample detection for pig proliferative enteropathy.Progress in Veterinary Medicine, 2014, 35(4): 89-93.(in Chinese)

[18] 曲向陽, 姚火春, 張璇, 黃濤, 李喜煥.華東地區規?；i場的回腸炎流行病學調查.中國預防獸醫學報, 2012, 34(11): 873-877.

QU X Y, YAO H C, ZHANG X, HUANG T, LI X H.Epidemiological survey of porcine ileitis on intensive swine farms in East China.Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine, 2012, 34(11): 873-877.(in Chinese)

[19] 黃忠, 宋長緒, 王浩文, 方樹河.華南五省區豬增生性腸炎的血清學調查.中國獸醫科學, 2006, 36(9): 748-751.

HUANG Z, SONG C X, WANG H W, FANG S H.Serological investigation of porcine proliferative enteronitis in five provinces of South China.Veterinary Science in China, 2006, 36(9): 748-751.(in Chinese)

[20] 劉新軍.表達布氏桿菌基因的重組沙門氏菌的構建及不同種布氏桿菌鑒別PCR檢測方法的建立[D].武漢：華中農業大學, 2010.

LIU X J.Construction of recombinant.Cholerasuis expressinggene and establishment of PCR detection method for identification of[D].Wuhan：Huazhong Agricultural University,2010.(in Chinese)

[21] VANNUCCI F A, FOSTER D N, GEBHART C J.Laser microdissection coupled with RNA-seq analysis of porcine enterocytes infected with an obligate intracellular pathogen ().BMC Genomics, 2013, 14: 421.

[22] BENGTSSON R J, MACINTYRE N, GUTHRIE J, WILSON A D, FINLAYSON H, MATIKA O, PONG-WONG R, SMITH S H, ARCHIBALD A L, AIT-ALI T.infection of intestinal crypt cells is associated with specific depletion of secreted MUC2in goblet cells.Veterinary Immunology and Immunopathology, 2015, 168(1/2): 61-67.

[23] 孫娜, 劉杏, 陳強, 劉瑩, 溫永俊, 程世鵬.胞內勞森菌PCR檢測方法的建立及初步應用.中國獸醫學報, 2017, 37(1): 36-39.

SUN N, LIU X, CHEN Q, LIU Y, WEN Y J, CHENG S P.Establishment and primary application of PCR method for detection of.Chinese Journal of Veterinary Science, 2017, 37(1): 36-39.(in Chinese)

[24] 彭忠, 涂志勤, 梁婉, 胡睿銘, 王豪男, 壽琎, 董超, 李宗華, 陳煥春.胞內勞森菌巢式PCR檢測方法的建立及初步臨床應用.中國獸醫學報, 2017, 37(1): 40-46.

PENG Z, TU Z Q, LIANG W, HU R M, WANG H N, SHOU J, DONG C, LI Z H, CHEN H C.Development and preliminary application of a nested PCR method for detection ofin feces of pigs.Chinese Journal of Veterinary Science, 2017, 37(1): 40-46.(in Chinese)

[25] PEDERSEN K S, STEGE H, JENSEN T K, GUEDES R, ST?HL M, NIELSEN J P, HJULSAGER C, LARSEN L E, ANGEN ?.Diagnostic performance of fecal quantitative real-time polymerase chain reaction for detection of-associated proliferative enteropathy in nursery pigs.Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, 2013, 25(3): 336-340.

[26] LI Y N, WANG J C, WANG J F, LIU L B, ZHANG R X, SHI R H, HAN Q G, SUN J G, YUAN W Z.A real-time loop-mediated isothermal amplification method for rapid detection ofin porcine fecal samples.Journal of Microbiological Methods, 2018, 151: 62-65.

[27] RICHTER B, LADINIG A, NEDOROST N, WEISSENB?CK H.A TaqMan quantitative polymerase chain reaction assay for the detection ofin fecal and tissue samples from pigs.Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, 2010, 22(1): 70-73.

[28] 鄭新添, 黃翠琴, 黃其春, 戴愛玲, 譚曉珺.胞內勞森菌SYBR Green Ⅰ real-time PCR檢測方法的建立.西北農林科技大學學報(自然科學版), 2015, 43(12): 29-34.

ZHENG X T, HUANG C Q, HUANG Q C, DAI A L, TAN X J.Establishment of SYBR Green Ⅰ real-time PCR assay for detection of.Journal of Northwest A&F University (Natural Science Edition), 2015, 43(12): 29-34.(in Chinese)

[29] 白挨泉, 郭建超, 覃宗華, 蒲文珺, 馬春全, 李國清, 張浩吉.胞內勞森菌TaqMan熒光定量PCR檢測方法的建立.畜牧獸醫學報, 2014, 45(10): 1733-1738.

BAI A Q, GUO J C, QIN Z H, PU W J, MA C Q, LI G Q, ZHANG H J.Development of a TaqMan quantitative polymerase chain reaction assay for detecting.Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2014, 45(10): 1733-1738.(in Chinese)

[30] WU Y Y, TIAN K Y, ZHANG Y H, GUO H F, LI N, WANG Z, ZHAO J.Rapid and visual detection ofwith an improved recombinase polymerase amplification assay combined with a lateral flow dipstick.BMC Veterinary Research, 2019, 15(1): 97.

[31] 李晶梅, 朱薇, 秦紅剛, 靖志強, 廖園園, 于義娟, 肖敏, 袁剛, 謝紅玲.IFA和IPMA方法測定豬瘟兔化弱毒病毒含量.中國獸藥雜志, 2013, 47(10): 35-38.

LI J M, ZHU W, QIN H G, JING Z Q, LIAO Y Y, YU Y J, XIAO M, YUAN G, XIE H L.IFA and IPMA for HCLV titer detection.Chinese Journal of Veterinary Drug, 2013, 47(10): 35-38.(in Chinese)

[32] ZHANG J L, LIU W X, CHEN W Y, LI C C, XIE M M, BU Z G.Development of an immunoperoxidase monolayer assay for the detection of antibodies against peste des petits ruminants virus based on BHK-21 cell line stably expressing the goat signaling lymphocyte activation molecule.PLoS One, 2016, 11(10): e0165088.

[33] DIREKSIN K, JOO H, GOYAL S M.An immunoperoxidase monolayer assay for the detection of antibodies against swine influenza virus.Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, 2002, 14(2): 169-171.

[34] GUEDES R M C, GEBHART C J, WINKELMAN N L, MACKIE-NUSS R A.A comparative study of an indirect fluorescent antibody test and an immunoperoxidase monolayer assay for the diagnosis of porcine proliferative enteropathy.Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, 2002, 14(5): 420-423.

[35] 朱蘊暖, 張鑫, 朱向東, 陳建飛, 時洪艷, 石達, 馮力.豬傳染性胃腸炎病毒免疫過氧化物酶單層細胞試驗原位檢測方法的建立.中國預防獸醫學報, 2017, 39(3): 237-239.

ZHU Y N, ZHANG X, ZHU X D, CHEN J F, SHI H Y, SHI D, FENG L.Development of immunoperoxidase monolayer assay detecting transmissible gastroenteritis virus.Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine, 2017, 39(3): 237-239.(in Chinese)

[36] HUERTA B, ARENAS A, CARRASC L, MALDONADO A, TARRADAS C, CARBONERO, PEREA A.Comparison of diagnostic techniques for porcine proliferative enteropathy (infection).Journal of Comparative Pathology, 2003, 129(2-3): 179-185.

[37] WELLENBERG G J, ROOIJ E M A V, MAISSAN J, OIRSCHOT J T V.Evaluation of newly developed immunoperoxidase monolayer assays for detection of antibodies against.Clinical & Diagnostic Laboratory Immunology, 1999, 6(4):447.

[38] KROLL J J, ROOF M B, HOFFMAN L J, DICKSON J S,HARRIS D L.Hank.Proliferative enteropathy:a global enteric disease of pigs caused by.Animal Health Research Reviews, 2005, 6(2):173-197.

[39] LAWSON G H, MCORIST S, JASNI S, MACKIE R A.Intracellular bacteria of porcine proliferative enteropathy: cultivation and maintenance.Journal of Clinical Microbiology, 1993, 31(5): 1136-1142.

[40] MIRAJKAR N S, KELLEY M R, GEBHART C J.Draft genome sequence ofstrain E40504, isolated from a horse diagnosed with equine proliferative enteropathy.Genome Announcements, 2017, 5(19).

[41] MCORIST S, GEBHART C J, BOSWORTH B T.Evaluation of porcine ileum models of enterocyte infection by.Canadian Journal of Veterinary Research, 2006, 70(2): 155-159.

[42] OH Y S, LEE J B, MCORIST S.Microarray analysis of differential expression of cell cycle and cell differentiation genes in cells infected with.Veterinary Journal, 2010, 184(3): 340-345.

[43] VANNUCCI F A, WATTANAPHANSAK S, GEBHART C J.An Alternative Method for Cultivation of.Journal of Clinical Microbiology, 2012, 50(3):1070-1072.

[44] 李磊.胞內勞森菌IPMA抗體檢測方法的建立及豬源性胞內勞森菌在小鼠體內的復制[D].南京: 南京農業大學, 2014.

LI L.Establishment ofantibody detection method and replication of porcinein mice [D].Nanjing: Nanjing Agricultural University, 2014.(in Chinese)

Establishment and Preliminary Application ofIPMA Antigen Detection Method Based on SodC Monoclonal Antibody

LI MinXue1,LI JianNan1, ZHOU Hong1, XIAO Ning1, LIN HuiXing1, MA Zhe1, FAN HongJie1, 2*

1College of Veterinary Medicine, Nanjing Agricultural University, Nangjing210095;2Jiangsu Co-innovation Center for the Prevention and Control of Important Animal, Yangzhou University Yangzhou, Yangzhou 225009 Jiangsu

【Objective】() is an enteric pathogenic bacteria that causes porcine proliferative enteropathy (PPE), which mainly shows the decline of animal welfare and causes serious economic losses to the world swine industries.The objective of this study was to prepare monoclonal antibodies against SodC of, and to establish an immunoperoxidase monolayer assay (IPMA) method for detectingbase the monoclonal antibody, while test its application in clinical practice, so as to provide a scientific and effective means for the diagnosis of【Method】In this study, the commercial live attenuatedvaccine was selected as target strain.Thegene was amplified by PCR and cloned into the prokaryotic expression vector pGex-6p-1.The recombinant plasmid pGex-6p-1-was confirmed to be constructed successfully and induced expression of recombinant SodC protein.The reactivity of the recombinant protein was analyzed by Western Blot.The primary antibody was a mouse anti-GST labeled antibody.BALB/c mice aged 4-6 weeks were immunized with purified SodC protein, and hybridoma cells were screened by conventional cell fusion, limited dilution and indirect ELISA, then ascites were prepared.It was confirmed that two monoclonal antibodies had good specificity through indirect immunofluorescence (IFA).Using the monoclonal antibody as the primary antibody, a method of IPMA for detectingwas developed, and the specificity, sensitivity and repeatability of the method were evaluated.The optimized IPMA method was used to detect ileal tissue samples from pig farms in Jiangsu Province and to evaluate the clinical value of the method.【Result】After purification, the concentration of SodC protein was higher, and it specifically bound to the antibody against GST tag, indicating that the protein had good regenicity.After three times of subcloning, two strains positive hybrid tumor cells were screened, named 1D6 and 1F7, respectively.The titers of two monoclonal antibodies were both reached 1﹕204 000 by ELISA.The subclass identification results of antibodies showed the subclass of 1D6 was IgA，and subclass of 1F7 was IgG3.The result IFA showed that 1D6 and 1F7 had specific reaction with, but did not cross-react with, PEDV and TGEV.The ascites of the two monoclonal antibodies were both 1﹕1 024 000 by ELISA; IFA confirmed that the two monoclonal antibodies had good specificity.The optimized IPMA reaction conditions showed that when the dilution ratio of the primary antibody was 1:800 for 45 min, and the dilution ratio of the secondary antibody was 1﹕2 500 for 1h, the established IPMA exhibited the best performance.The specificity and sensitivity tests showed that, PEDV, TGEV, PCV2 and PRV were all negative, and the minimum detection limit was 103.The optimized IPMA method was used to detect the ileum tissue samples from pig farms in the surrounding areas of Jiangsu Province.A total of 92 positive samples were detected from 146 samples of ileal tissues.The positive rates of 3 different pig farms were 65.6%, 68.1% and 53.7%, respectively, and the overall positive rate was 63.0%.82 positive samples were detected by PCR method.and the positive coincidence rate of the two methods was 94.6%.These results indicated that this method had clinical value.【Conclusion】The monoclonal antibodies against the recombinant SodC protein were successfully prepared, and the IPMA method forwas established with good specificity and sensitivity, and the clinical samples were tested.In summary, these results further proved that the IPMA had certain clinical value, and provided an effective technical means for the isolation and identification ofin the laboratory, localization in infected cells, epidemiological investigation and quarantine.

; SodC protein; monoclonal antibody; an immunoperoxidase monolayer assay (IPMA)

2020-09-09；

2021-04-12

江蘇省農業科技自主創新資金（CX(19)2020）、江蘇省重點研發計劃（BE2017341）

李敏雪，Tel：13218030982；E-mail：2018107038@njau.edu.cn。通信作者范紅結，Tel：025-84399592；E-mail：fhj@njau.edu.cn

（責任編輯 林鑒非）