槲皮素的抗炎免疫及部分機制研究

司麗君 王 雪 王林林 黃 華

新疆維吾爾自治區藥物研究所，新疆烏魯木齊 830004

槲皮素（分子式：C15H10O7）是一種在植物中廣泛存在的黃酮類化合物[1]，其具有抗腫瘤[2]、抗氧化[3]、抗炎[4]、抗病毒[5]、免疫調節[6]等多種藥理活性。槲皮素也是新疆一枝蒿[7]、濱蒿[8]、天山雪蓮[9]、金蓮花[10-11]、沙棘[12]、沙棗[13]等具有抗炎作用的新疆地產民族藥的成分之一。研究表明，槲皮素對脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導RAW264.7 細胞釋放的一氧化氮、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素（interleukin，IL）-6 和IL-1β 有顯著的抑制作用[14-16]，且槲皮素可以增強免疫低下小鼠的免疫力[17]，但其對活性氧（reactive oxygen species，ROS）、單核細胞趨化蛋白1（monocyte chemoattractant protein 1，MCP1）和環氧合酶（cyclooxygenase，COX）的體外抑制作用，以及對正常小鼠免疫功能的影響少見報道。本研究通過進一步考察槲皮素對ROS、MCP1 和COX 的影響，并觀察槲皮素對正常小鼠脾淋巴細胞、T 細胞和B 細胞增殖的影響，探討槲皮素的抗炎和免疫調節作用，以期為槲皮素在炎癥及免疫疾病中的臨床應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 細胞株及動物

RAW264.7 細胞購自中國科學院上海生命科學研究院細胞庫；SPF 級BALB/C 雄性小鼠20 只，6～8 周齡，體重18～22 g，購自新疆醫科大學動物實驗中心，經新疆藥物研究所動物倫理委員會批準（XJIMM-2019004-1），實驗動物生產許可證號：SCXK（新）2018-0002，實驗動物質量合格證號：65000700001086。

1.2 主要試劑與儀器

槲皮素（中國藥品生物制品檢定所，含量為99.1%，批號：100081-201610）；LPS（Sigma，貨號：L2880）；伴刀豆球蛋白A（concanavalin A，Con A）（Solarbio，貨號：C8110）；2’，7’-二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）（Sigma，貨號：D6883）；酶聯免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒[Thermo Fisher，TNF-α 貨號：88-7324；IL-6 貨號：88-7064；γ 干擾素（interferon-γ，IFN-γ）貨號：88-7314]，MCP1（武漢華美，貨號：CSB-E07430m）；COX 抑制劑篩選試劑盒（Cayman Chemical Company，貨號：700100）；微孔板檢測儀，美國美谷分子儀器（型號：SpectraMax M2）。

1.3 研究方法

1.3.1 RAW264.7 細胞采用含10%胎牛血清的1640 培養基培養，以2×104個/孔接種在96 孔板中，采用不同濃度的槲皮素（125.00、62.50、31.25、15.60、7.80、3.90、1.95、0.98、0 μg/ml）對其進行干預，每組4 個復孔。觀察其對RAW 264.7 細胞活力的影響，采用MTS 法檢測細胞活力，選擇對細胞活力無影響的濃度的槲皮素以進行下一步研究。

1.3.2 以無處理的RAW 264.7 細胞為空白組，采用1 μg/ml LPS 刺激RAW 264.7 細胞建立炎癥細胞模型[8]，將其分為模型組，槲皮素0.98、1.95、3.90、7.80 μg/ml劑量組，每組4 個復孔。采用MTS 法檢測細胞活力，DCFH-DA 法測定ROS 含量[8]，ELISA 檢測MCP1 水平。

1.3.3 按照COX 抑制劑篩選試劑盒說明書進行檢測，計算抑制率：抑制率=（100%酶活性對照組-給藥組）/100%酶活性對照組×100%。以濃度為橫坐標，抑制率為縱坐標，非線性回歸求得IC50值。

1.3.4 將小鼠處死，參考文獻[18]制備細胞密度為2×106個/ml 的脾淋巴細胞懸液，接種于96 孔板，每孔100 μl，采用不同濃度的槲皮素（7.80、3.90、1.95、0.98、0 μg/ml）對小鼠脾淋巴細胞進行干預，觀察其對細胞增殖情況的影響。以無處理的小鼠脾淋巴細胞為對照組，將經LPS（10 μg/ml）或Con A（8 μg/ml）處理的小鼠脾淋巴細胞分為LSP 組、Con A 組，以及槲皮素0.98、1.95、3.90、7.80 μg/ml 劑量組，每組4 個復孔。采用MTS 法檢測不同濃度槲皮素對小鼠脾淋巴細胞、Con A 誘導的T 細胞和LPS 誘導的B 細胞增殖情況，采用ELISA試劑盒檢測Con A 組及槲皮素各濃度組中TNF-α、IL-6、INF-γ 的水平。

1.4 統計學方法

采用SPSS 17.0 對所得數據進行統計學分析，計量資料采用均數±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Scheffe 法。以P ＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度槲皮素對RAW 264.7 細胞活力的影響

槲皮素＜7.80 μg/ml 時RAW 264.7 細胞活力與未處理時比較，差異無統計學意義（P ＞0.05）。見圖1。

圖1 不同濃度槲皮素對RAW 264.7 細胞活力的影響（n=4）

2.2 不同濃度槲皮素對LPS 誘導的RAW 264.7 細胞ROS 和MCP1 水平的影響

模型組ROS、MCP1 含量高于空白組，槲皮素0.98、1.95、3.90、7.80 μg/ml 劑量組ROS、MCP1 含量低于模型組，差異有統計學意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）。見圖2。

圖2 不同濃度槲皮素對LPS 誘導的RAW 264.7 細胞ROS 和MCP1 水平的影響（n=4）

2.3 槲皮素對COX-1、COX-2 抑制活性的影響

槲皮素對COX-1、COX-2 的IC50分別為12.73、0.44 μg/mL，COX-2 與COX-1 的IC550比值為0.034。

2.4 不同濃度槲皮素對小鼠脾淋巴細胞增殖的影響

槲皮素濃度為0.98、1.95、3.90、7.80 μg/ml 時小鼠脾淋巴細胞增殖均高于未處理時，差異有統計學意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）。見圖3。

圖3 不同濃度槲皮素對小鼠脾淋巴細胞增殖的影響（n=4）

2.5 不同濃度槲皮素對小鼠T、B 細胞增殖及T 細胞中TNF-α、IL-6 和INF-γ 水平的影響

Con A 組T 細胞及LPS 組B 細胞均高于對照組，差異有高度統計學意義（P ＜0.01）。槲皮素1.95、3.90、7.80 μg/ml 劑量組T 細胞低于Con A 組，槲皮素3.90、7.80 μg/ml 劑量組B 細胞低于LPS 組，差異有統計學意義（P ＜0.05），見圖4。Con A 組TNF-α、IL-6 和INF-γ水平均高于對照組，槲皮素1.95、3.90、7.80 μg/ml劑量組TNF-α 水平低于Con A 組，槲皮素各劑量組IL-6 和INF-γ 水平均低于Con A 組，差異有高度統計學意義（P ＜0.01），見圖5。

圖4 不同濃度槲皮素對小鼠T、B 細胞增殖的影響（n=4）

圖5 不同濃度槲皮素對小鼠T 細胞中TNF-α、IL-6 和INF-γ 水平的影響（n=4）

3 討論

LPS 刺激小鼠巨噬細胞RAW264.7 是評價藥物抗炎活性的經典炎癥細胞模型。本研究通過RAW264.7炎癥模型發現，槲皮素可減少炎癥細胞ROS 和MCP1的釋放。ROS 具有細胞毒性，可引起DNA 損害、脂質過氧化增強、氨基酸氧化反應破壞及細胞凋亡[19]。MCP1 可促進炎癥反應的發生，對單核/巨噬細胞具有特異性趨化激活作用[20-21]。本研究結果顯示，槲皮素對炎癥細胞中ROS 和MCP1 的釋放均有很好的抑制作用。

花生四烯酸炎癥代謝網絡中的COX 是抗炎藥物的重點靶標[22-23]。研究發現，藥物對COX-1 的抑制可引起不良反應，而對COX-2 的抑制則產生抗炎作用，COX-2 選擇性抑制劑將使藥物的安全性大大提高。COX-2 抑制劑選擇性是通過體外試驗測定COX-2與COX-l 的IC50比值來篩選的[24]，本研究結果顯示，槲皮素對COX-2 與COX-l 的IC50比值為0.034，提示槲皮素是COX-2 選擇性抑制劑。

本研究顯示槲皮素能促進小鼠脾淋巴細胞的增殖，又能抑制其T、B 細胞的增殖，抑制T 細胞分泌TNF-α、IL-6、INF-γ，這是否與槲皮素可以抑制抗CD3+和抗CD28+活化的初級人類T 細胞的增殖及減少IL-2 的產生有關[25]，有待進一步研究。

綜上所述，槲皮素具有選擇性抑制COX-2、巨噬細胞炎癥反應的作用，還能促進小鼠脾淋巴細胞的增殖，抑制T、B 細胞的增殖。本研究有助于揭示槲皮素在調控炎癥及免疫疾病中的潛在應用價值。槲皮素的炎癥保護作用及免疫調節的具體分子機制及靶點還有待于今后的進一步深入研究。