云芝五味子浸膏對(duì)柳氮磺胺吡啶致小鼠肝損傷的影響

于海濤 王群英 苗 青 董文珠

1.解放軍海軍第九七一醫(yī)院消化內(nèi)科，山東青島 266071；2.解放軍海軍第九七一醫(yī)院藥劑科，山東青島 266071

近年來(lái)，臨床上藥源性肝損傷病例日益增多，其中過(guò)量使用抗菌藥物是引起肝損傷的重要原因[1-2]。柳氮磺胺吡啶屬于磺胺類抗菌藥物，臨床常用于潰瘍性結(jié)腸炎的治療。但由于其具有一定的肝毒性，甚至?xí)鸩糠只颊甙l(fā)生肝衰竭[3]，導(dǎo)致柳氮磺胺吡啶的臨床應(yīng)用受到限制。但在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎等疾病的治療上，柳氮磺胺吡啶具有良好的效果，具有一定的臨床價(jià)值。因此，如何防止或減輕其造成的肝損害，仍是一個(gè)值得研究的重要課題[4-5]。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的進(jìn)步，臨床發(fā)現(xiàn)多種中藥都具有良好的保肝作用。然而保肝藥物通常具有一定的特異性，針對(duì)不同原因引起的肝損傷效果可能不同，這些保肝中藥對(duì)于柳氮磺胺吡啶所致肝損傷是否有效目前還缺乏具體的理論研究。云芝是一種常用中藥，研究顯示其具有保肝消炎、抗氧化等生物活性[6-8]，有報(bào)道認(rèn)為云芝多糖對(duì)酒精、對(duì)乙酰氨基酚、四氯化碳導(dǎo)致的肝損傷具有良好的保護(hù)效果[9-11]。五味子同樣是一種常見的具有保肝作用的中藥，已經(jīng)被臨床廣泛應(yīng)用。近期有研究發(fā)現(xiàn)，云芝五味子浸膏對(duì)于急性酒精性肝損傷具有明顯的保護(hù)作用[12]，因此本研究選取云芝五味子浸膏觀察其對(duì)柳氮磺胺吡啶引起的小鼠肝損傷的保護(hù)作用，期望找出針對(duì)此種肝損傷保護(hù)效果較好的中藥。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性SPF 級(jí)ICR 小鼠，體重18～22 g，6 周齡，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（湘）2016-0002，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：430727180 101883282。飼養(yǎng)室內(nèi)溫度控制為20～22℃，濕度40%～60%，8:00—20:00 為光照時(shí)間。

1.2 藥品和試劑

柳氮磺胺吡啶（S129986），購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；熊去氧膽酸（20180206），購(gòu)自德國(guó)福克制藥；五味子、云芝購(gòu)自中國(guó)人民解放軍海軍第九七一醫(yī)院，均符合2015 年版《中華人民共和國(guó)藥典》[13]的相關(guān)項(xiàng)下要求；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（glutamic-pyruvic transaminase，GPT）（20180704）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（glutamicoxaloacetic transaminase，GOT）（20180704）和堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）試劑盒（20180704），購(gòu)自上海復(fù)星長(zhǎng)征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司。

1.3 儀器

GA-PSU 獨(dú)立送風(fēng)隔離籠具（蘇州市馮氏實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)備有限公司）；90i 全自動(dòng)顯微圖像分析系統(tǒng)（日本尼康公司）；AU400 全自動(dòng)生化分析儀（日本奧林巴斯公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 藥液的制備 云芝五味子浸膏提取過(guò)程：將云芝600 g 和五味子120 g 清洗干凈，加入10 倍量蒸餾水，蒸煮3 h；再加入10 倍量蒸餾水，繼續(xù)蒸煮3 h，8 層紗布過(guò)濾，所得濾液即為所需藥物[12]。后續(xù)使用生理鹽水將其稀釋為所需濃度。柳氮磺胺吡啶和熊去氧膽酸均混懸于0.5%羧甲基纖維素鈉（sodium carboxymethyl cellulose，CMC-Na）溶液，使藥物濃度分別為0.100 g/ml和0.001 g/ml。

1.4.2 動(dòng)物分組 適應(yīng)喂養(yǎng)1 周后，采用編號(hào)法對(duì)ICR小鼠進(jìn)行隨機(jī)編號(hào)，在電腦上從每6 只中隨機(jī)抽取1 只編入一組，共設(shè)6 組，每組10 只。分別為對(duì)照組，模型組，熊去氧膽酸組，云芝五味子浸膏低、中、高劑量組。

1.4.3 造模方法 除對(duì)照組外，其余各組均每日以柳氮磺胺吡啶溶液（1000 mg/kg，混懸于0.5%CMC-Na）灌胃給藥制備肝損傷模型；熊去氧膽酸組和云芝五味子浸膏低、中、高劑量組在柳氮磺胺吡啶給藥2 h 后，分別給予熊去氧膽酸（10 mg/kg）和云芝五味子浸膏溶液（50、100、300 mg/kg）灌胃；模型組與對(duì)照組給予等體積0.5% CMC-Na 溶液，給藥體積為均10 ml/kg，各組干預(yù)均持續(xù)14 d。第15 天所有小鼠空腹12 h 后處死。

1.5 指標(biāo)檢測(cè)

各組摘眼球取血后分離血清，采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定GPT、GOT 和ALP 活性。脫頸處死小鼠，迅速取出肝臟，稱重，固定于10%甲醛中。切出規(guī)則方形小塊（0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm），置于包埋盒內(nèi)。流水沖洗，脫水，透明，浸蠟，包埋。切3 μm 厚石蠟切片，進(jìn)行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察各組肝組織病理變化，并拍照。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0 對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，多組計(jì)量資料比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q 檢驗(yàn)。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 六組肝損傷血清學(xué)指標(biāo)比較

模型組GPT、GOT、ALP 水平均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。云芝五味子浸膏低、中、高劑量組GPT、GOT、ALP 均低于模型組，且云芝五味子浸膏中、高劑量組均低于云芝五味子浸膏低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）。見表1。

表1 六組肝損傷血清學(xué)指標(biāo)比較（U/L，）

表1 六組肝損傷血清學(xué)指標(biāo)比較（U/L，）

注：與對(duì)照組比較，aP ＜0.05；與模型組比較，bP ＜0.05，bbP ＜0.01；與云芝五味子浸膏低劑量組比較，cP ＜0.05。GPT：谷丙轉(zhuǎn)氨酶；GOT：谷草轉(zhuǎn)氨酶；ALP：堿性磷酸酶

2.2 各組肝臟病理組織學(xué)結(jié)果

對(duì)照組肝臟病理切片顯示：該組肝細(xì)胞以中央靜脈為中心，肝細(xì)胞呈放射狀向周圍擴(kuò)散，排列有規(guī)律，肝細(xì)胞飽滿、清晰可見；模型組肝細(xì)胞出現(xiàn)明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肝細(xì)胞破裂、壞死，肝小葉失去正常結(jié)構(gòu)，肝索排列紊亂；熊去氧膽酸組部分肝細(xì)胞出現(xiàn)腫脹，但肝小葉結(jié)構(gòu)尚完整，未見明顯的炎細(xì)胞浸潤(rùn)，較模型組明顯好轉(zhuǎn)；云芝五味子浸膏各組肝細(xì)胞壞死及肝小葉結(jié)構(gòu)較模型組明顯好轉(zhuǎn)，其中云芝五味子浸膏中、高劑量組較低劑量組好轉(zhuǎn)。見圖1。

圖1 各組病理切片（蘇木精-伊紅染色，200×）

3 討論

柳氮磺胺吡啶在臨床上常用于治療潰瘍性結(jié)腸炎、強(qiáng)直性脊柱炎等，雖然效果顯著，但長(zhǎng)期使用可致患者肝臟損害甚至急性肝壞死[14-17]。因此，為了更好地發(fā)揮柳氮磺吡啶的臨床治療作用，需要找到能防止或降低其引起肝損傷的藥物。本研究以柳氮磺胺吡啶誘導(dǎo)小鼠肝損傷為模型，旨在尋找針對(duì)柳氮磺胺吡啶所致肝損傷的保肝中藥。本研究通過(guò)將柳氮磺胺吡啶對(duì)小鼠進(jìn)行灌胃處理，檢測(cè)到小鼠血清學(xué)肝功指標(biāo)GPT、GOT 和ALP 水平較對(duì)照組顯著升高，證實(shí)肝損傷模型建立成功[18]。既往研究表明，柳氮磺胺吡啶引起的肝損傷以急性肝細(xì)胞損傷為主，可以引起GPT、GOT 和ALP 的升高[15]，同時(shí)也有報(bào)道認(rèn)為柳氮磺吡啶引起的肝損傷可以導(dǎo)致瘀膽型肝炎[19]。因此，本研究采用熊去氧膽酸作為陽(yáng)性對(duì)照藥。熊去氧膽酸屬于傳統(tǒng)的保肝藥物，可以促進(jìn)膽汁酸的分泌，保護(hù)肝細(xì)胞的細(xì)胞膜，從而發(fā)揮保肝作用[20]。

云芝是多孔菌科真菌彩絨革蓋菌的干燥子實(shí)體，是一種常用中藥[13]。既往研究顯示，云芝具有保肝、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛等多種療效。報(bào)道認(rèn)為云芝多糖對(duì)于對(duì)乙酰氨基酚導(dǎo)致的肝損傷具有良好的保護(hù)作用[10,21]。王康樂(lè)等[9]研究發(fā)現(xiàn)，云芝多糖對(duì)酒精性肝損傷具有保護(hù)作用，其能有效降低酒精性肝損傷小鼠模型血清中轉(zhuǎn)氨酶及血脂的水平，起到較好的保肝作用。五味子為木蘭科植物五味子或華中五味子的干燥成熟果實(shí)，有研究表明，五味子提取物可改善化學(xué)物質(zhì)導(dǎo)致的肝損傷，能明顯降低肝損傷而導(dǎo)致的轉(zhuǎn)氨酶升高，促進(jìn)膽汁的正常分泌[22]。人體中具有四氯化碳毒性的代謝產(chǎn)物可以通過(guò)脂質(zhì)過(guò)氧化造成急性肝損傷，五味子的醇提物可抵抗這一作用[23]。五味子對(duì)對(duì)乙酰氨基酚造成的肝損傷也有較好的療效[24]。馮耀培等[12]將云芝與五味子配伍嘗試研究其對(duì)急性酒精性肝損傷的保護(hù)，研究發(fā)現(xiàn)云芝五味子浸膏能夠顯著降低酒精性肝損傷小鼠中血清GPT、GOT 的水平，改善小鼠肝細(xì)胞的變性、壞死。本研究發(fā)現(xiàn)云芝五味子浸膏不僅能夠降低柳氮磺吡啶所致肝損傷小鼠血清中GPT、GOT、ALP 的水平，同樣能夠改善小鼠肝細(xì)胞的排列分布，減輕炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和肝細(xì)胞壞死。本研究結(jié)果顯示，云芝五味子浸膏能夠有效保護(hù)柳氮磺吡啶引起的肝細(xì)胞損傷。在不同劑量組中，中、高劑量組在降低血清肝功標(biāo)志物和改善肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)方面較低劑量組有顯著改善，但中、高劑量組之間沒有明顯變化，提示云芝五味子浸膏的保肝作用隨著劑量的增加呈現(xiàn)一定的劑量相關(guān)性，但并不是劑量越高越好，仍需要尋找一個(gè)最佳的量效值。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)云芝和五味子配伍后針對(duì)柳氮磺吡啶所致肝損傷具有較好的保護(hù)作用，為云芝和五味子的配伍使用提供了一定的理論支持。既往研究認(rèn)為五味子發(fā)揮保肝作用主要與Nrf2 信號(hào)通路、p53/p21 信號(hào)通路、核因子κB 信號(hào)通路及絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路有關(guān)[25]，云芝的保肝機(jī)制可能是抑制肝臟氧化應(yīng)激，改善機(jī)體相關(guān)酶類及細(xì)胞因子相關(guān)[11]。云芝和五味子配伍后是否仍通過(guò)這些途徑發(fā)揮保肝作用仍需要進(jìn)一步的深入研究，同時(shí)云芝和五味子浸膏的臨床使用也需要更多的研究提供支持。