電針智三針對血管性癡呆大鼠Syt-4、IL-18、C3a表達的影響

布雨 魏宇唯 唐中生 林吉 朱世杰 謝高宇

(貴州中醫藥大學基礎醫學院，貴州 貴陽 550025)

血管性癡呆(VaD)是指由腦缺血、缺氧、出血、梗死等原因導致的腦血管損傷引發的以學習記憶功能障礙為主的疾病。VaD患病人數逐年上升，嚴重危害人們的健康〔1〕，但在生活中積極進行防治，VaD是為數不多的可以得到有效控制的癡呆。突觸可塑性改變和免疫炎性反應是影響學習記憶能力的重要因素。突觸結合蛋白(Syt)-4與突觸的活性依賴性調節相關，是海馬形成突觸可塑性的突觸調節蛋白〔2〕，影響學習記憶能力。白細胞介素(IL)-18、C3a均促進炎癥級聯反應，加重組織損傷程度。課題組在先前實驗中證實了電針智三針具有改善VaD學習記憶能力的作用〔3～5〕。在此基礎上本實驗通過檢測電針智三針治療前后VaD大鼠海馬CA1區Syt-4表達和血清IL-18、補體C3a的含量，探討電針智三針改善VaD學習記憶能力相關突觸可塑性和免疫炎性反應的可能機制。

1 材料和方法

1.1實驗動物 SPF級健康雄性SD大鼠98只，體重280～300 g，重慶滕鑫比爾實驗動物銷售有限公司，許可證號：SCXK(軍)2013-0011。

1.2器材與試劑 華佗牌電針治療儀(蘇州醫療用品有限公司)；尼莫地平片(亞寶藥業)；IL-18和補體C3a的酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒(伊萊瑞特)；兔多克隆抗體(北京博奧森生物科技有限公司)；山羊抗兔工作液(北京中杉金橋生物有限公司)；超純RNA提取試劑盒(康為世紀公司)；熒光染料一步法反轉錄qPCR試劑盒(Vazyme公司)；透射電子顯微鏡(日本電子株式會社)；徠卡組織處理機(徠卡微系統有限公司)。

1.3VaD大鼠模型的建立 VaD大鼠模型采用改良的Pulsinelli四血管阻斷法(4-VO)建立。用3%戊巴比妥鈉進行腹腔麻醉，施行背側頸正中切口，電凝針燒灼雙側第一頸椎椎動脈，以形成永久性閉塞。再施行腹側頸正中切口，將雙側頸總動脈分離后穿線備用。24 h后用微動脈夾重復夾閉雙側頸總動脈3次，每次5 min，間隔1 h。在4條血管阻斷后2 min內，出現瞳孔散大，虹膜發白判定為模型制作成功。采用隨機數字表法將成活的VaD大鼠分為模型組、電針智三針組和尼莫地平組，并設假手術組為對照。假手術組不進行燒灼和夾閉動脈。除去治療過程中死亡的大鼠，保證每組應有數量。

1.4治療方法 自模型建立第8天開始連續治療20 d，每日上午9∶00～11∶00進行一次治療。電針智三針組選取神庭穴及本神穴，針的規格為28號、25 mm(1寸)，以平刺，進針13 mm(0.5寸)進行針刺操作后連接電針儀，給予連續波20 Hz，20 min。尼莫地平組大鼠每日按20 mg/(kg·d)的用量進行灌胃。模型組和假手術組大鼠按照1 ml/100 g蒸餾水配比標準進行灌胃。

1.5Morris水迷宮檢測學習記憶 治療后第21天進行為期1 w的水迷宮測試。前6 d每日各檢測定向航行試驗1次，將大鼠按Ⅰ～Ⅳ象限依次從各象限水池壁中點靠池壁邊緣放入水中，記錄60 s內大鼠從水中爬上站臺的時間，超過60 s爬上站臺所用的時間也記為60 s；第7天行空間探索試驗，記錄2 min內大鼠在第三象限游泳時間和穿越平臺次數。數據由電腦自動采集。

1.6ELISA檢測C3a、IL-18含量 3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠后，剪斷股動脈采血。將全血樣品于室溫放置2 h或4℃過夜后于1 020 r/min離心20 min，取上清并按照ELASA試劑盒說明進行操作，在450 nm波長處測定各樣本OD值，求得各樣本C3a、IL-18濃度值，取平均值作為各動物血清C3a、IL-18含量。

1.7Real-time PCR檢測海馬CA1區Syt-4的含量 取新鮮大鼠海馬，用總RNA提取試劑盒提取海馬總RNA，引物設計后進行Real-time PCR檢測。反應程序：55℃逆轉錄5 min后，95℃預變性5 min，95℃，10 s，60℃，30 s，循環反應40次。PCR各檢測樣本的CT值用QuantStudio1Design & Analysis Software軟件分析。通過2-△△Ct計算X相對mRNA表達水平。采用引物序列：Syt-4:上游5'-GTCAATTCGGGTTTCAGCCACGTCTGGAGT-3',下游5'-TTGAGATCGTTTGGGCAAAAGCGGCAGTTT-3'。

1.8免疫組織化學法檢測海馬CA1區Syt-4表達 3%戊巴比妥鈉對大鼠進行腹腔麻醉，行心臟灌流固定后，開顱取出大鼠腦組織迅速放入4%多聚甲醛中，經至少24 h浸泡固定后取大鼠海馬CA1區，切割成3 mm厚的腦片，經脫水、透明、包埋、孵育和修復。在切片上滴加山羊血清封閉液，室溫孵育20 min；再滴加一抗，4℃過夜；滴加二抗，37℃，30 min；磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，每次5 min；使用二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒，顯微鏡下觀測室溫2 min時切片顯色，蒸餾水對切片進行充分洗滌；并使用蘇木素復染，脫水，透明，最后封片。

1.9透射電鏡觀察海馬CA1區超微結構 將大鼠海馬組織剪切成1 mm×1 mm×1 mm大小的組織塊，先用3%戊二醛預固定，再用1%四氧化鋨固定。使用丙酮按照30%→50%→70%→80%→90%→95%→100%(100%濃度中換3次)的濃度梯度進行脫水。再將樣品放入脫水劑和環氧樹脂(型號為Epon812)滲透液中滲透40 min，將滲透好的樣品包埋、固化，使用超薄切片機將樣品切割成50 nm厚的超薄切片。在室溫下用醋酸鈾和枸櫞酸鉛一次染色20 min，最后用JEM-1400PLUS透射電鏡觀察。

1.10統計學分析 應用SPSS25.0軟件進行單因素方差分析或非參數檢驗。

2 結 果

2.1Morris水迷宮結果 經6 d的引導練習后，模型組平均逃避潛伏期比假手術組明顯延長(P<0.01)；電針智三針組和尼莫地平組平均逃避潛伏期比模型組顯著縮短(P<0.01)，模型組在第3象限活動時間縮短、穿越站臺次數顯著減少，與假手術組比較有顯著差異(P<0.01);電針智三針組和尼莫地平組第3象限活動時間延長、穿越站臺次數明顯增多，與模型組比較有顯著差異(P<0.01)。見表1。

表1 各組平均逃避潛伏期、第3象限活動時間、穿越平臺次數

2.2ELISA檢測結果 模型組血清IL-18、C3a含量明顯高于假手術組(P<0.01)，與模型組比較，電針智三針組和尼莫地平組血清IL-18、C3a含量明顯降低(P<0.01)。見表2。

表2 各組血清中IL-18、C3A表達情況

2.3Real-time PCR檢測結果 與假手術組比較，模型組海馬Syt-4 mRNA表達顯著升高(P<0.01),與模型組比較，電針智三針組及尼莫地平組海馬Syt-4 mRNA表達顯著降低(P<0.01)，而電針智三針組與尼莫地平組之間差異無顯著性(P>0.01)，見表3。

2.4免疫組織化學顯色結果 陰性細胞呈藍色，陽性細胞呈黃色或棕黃色不等，底物為白色，背景為淡紫色，陽性產物主要分布在細胞質及細胞間質。Syt-4在假手術組表達罕見，在模型組呈現高表達，在尼莫地平組、電針智三針組表達較少，見表3，圖1。

圖1 Sy-4顯微圖像(免疫組化，×400)

表3 大鼠腦組織Syt-4表達情況

2.5各組大鼠海馬CA1區超微結構分析 假手術組突觸數量豐富且形態完整、清晰，細胞器結構完整；模型組突觸數量急劇減少，且突觸間隙模糊或消失，突觸小泡較少，線粒體腫脹或空泡化，線粒體嵴斷裂或消失，細胞核固縮，細胞核膜內陷，呈半月板狀和圓月狀；電針智三針組突觸數量豐富，形態基本清晰完整，突觸小泡豐富，細胞核膜皺縮內陷改善不明顯，細胞核仁碎裂；尼莫地平組突觸結構基本正常，數量較多，線粒體結構完整，細胞核膜內陷較輕，見圖2。

圖2 透射電鏡觀察大鼠海馬CA1區超微結構(×10 000)

3 討 論

VaD主要是指由腦血管疾病導致腦組織缺血或出血引起的認知功能損害綜合征。有研究表明針刺可以加強經脈之間的聯系，激發經氣，疏通已損經絡，調節腦神經代謝，提高學習記憶能力〔7〕。著名針灸學家靳瑞提出電針智三針治療VaD，驗之臨床，收效頗豐〔8〕。智三針所取穴位神庭和本神，均位于前額，是與神志有關的穴位。神庭穴為腦內元神之所藏，是督脈、太陽及足陽明交會穴，督脈絡腦和腎，“并于脊里”“入腦”“上巔”，可作為傳輸精氣的主要通路，對督脈經氣進行調節。本神是足少陽膽經循經傳來的氣血交匯之處，是諸神之本，現代醫療常將此穴用于治療腦血管疾病。電針智三針的作用機制可能是通過電針特定的穴位，刺激了大腦皮質相應投射區，從而起到調節突觸可塑性和炎癥因子釋放的作用，抑制海馬神經元損傷和細胞的免疫炎性損傷，以此改善和修復腦功能〔9～11〕。

Syt-4是突觸囊泡蛋白的一種亞型，大量存在于中樞神經系統中，在神經遞質釋放中具有活性。Ferguson等〔12,13〕發現在基因突變小鼠海馬中syt-4的缺失表現在小鼠精細運動與記憶能力的下降；七氟烷造成大鼠認知功能損傷后，Syt-4抑制突觸前傳遞并且在海馬中的表達升高〔14〕。Syt-4蛋白可調控刺激依賴性膜轉運，這可能影響大腦突觸的可塑性變化〔15〕。星形膠質細胞谷氨酸釋放的最重要的途徑是Ca2+依賴的囊泡胞吐作用，Syt-4是星形膠質細胞釋放谷氨酸的Ca2+傳感器，通過調控Syt-4參與星形膠質細胞谷氨酸釋放，使海馬相關的某些記憶形式出現異?！?6〕。過度釋放的谷氨酸促使N-甲基-D-天冬氨酸受體(NMDA)表達增強，而NMDA是突觸可塑性和海馬神經元長時程增強效應(LTP)的主要調控者〔17〕，通過影響神經元LTP，最終降低動物學習記憶能力。經證實針刺可以抑制谷氨酸受體的過度表達，從而起到保護神經元的作用〔18〕。在本實驗中VaD大鼠海馬CA1區Syt-4的表達明顯高于正常組，經過電針智三針治療后伴隨著海馬CA1區Syt-4表達水平減少，大鼠學習記憶能力明顯升高升高。這可能是通過減少Syt-4的表達從而減少Ca2+依賴性谷氨酸的釋放，恢復已損傷的神經膠質細胞，起到治療VaD的作用。

IL-18和C3a是通過介導炎癥級聯反應參與VaD的多種免疫機制炎癥反應過程。IL-18是目前發現在VaD中起重要作用的IL，研究發現腦梗死患者血清中IL-18水平升高，產生的過度炎癥反應影響正常細胞的成熟過程，加重腦損傷程度，影響老年人的認知功能〔19〕。而C3a在腦細胞激活及神經炎癥中也發揮著十分重要的作用。C3分子作為補體激活途徑的樞紐與多種相關因子均有相互作用，C3a作為C3的激活產物研究較少，目前C3與精神分裂癥及帕金森病等的相關性引起了學者的廣泛注意〔20〕，因此C3a在腦病領域的研究亟待探索和完善。本實驗證實了VaD大鼠血清中IL-18和C3a的含量明顯升高，電針智三針有效降低IL-18和C3a的含量，可能與減少炎癥級聯反應的發生有關。

Syt-4表達的升高促進谷氨酸的釋放，谷氨酸已被證實具有激活核因子(NF)-κB的作用，NF-κB被廣泛認為是典型的炎癥信號通路。研究發現C3a與其受體結合后激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族，并促使磷脂酰肌醇激酶3(PI3K)啟動，并在質膜上產生第二信使PIP3，PIP3與細胞內含有PH結構域的信號蛋白蛋白激酶B(Akt)和3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶(PDK)1結合，促使PDK磷酸化AKT蛋白的Ser308導致Akt活化〔21〕，最終C3a能夠激活PI3K/Akt通路。文獻報道Syt-4激活的NF-κB通路與C3a激活的PI3K/Akt通路能夠組成一條完整PI3K/Akt-NF-κB、缺氧誘導因子(HIF)-1α通路〔22〕。而在低氧條件下促進HIF-1產生的重要物質正是IL-18〔23〕。HIF-1在長期重度缺氧時可促進缺氧誘導的細胞凋亡。據此推測電針智三針治療VaD的作用機制可能與PI3K/Akt-NF-κB-HIF-1α通路有關，而Syt-4、IL-18、C3a的作用方式有相通之處并可以相互促進。

電針智三針以突觸改變為靶點治療VaD，不僅促進缺血后突觸的的重建與再生增強神經信息之間的傳遞，還抑制免疫炎性反應對機體產生的繼發性損害，為研究VaD的發病機制與治療提供一個新的思路。綜上所述，電針智三針能夠顯著改善VaD大鼠的學習記憶能力，可能與其降低VaD大鼠海馬Syt-4表達和降低大鼠血清IL-18、C3a含量，延緩海馬CA1區神經元損傷有關。