miR-183靶向Orai1基因影響高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞增殖和凋亡

李媛 孫愛(ài)東 許聿新 韓森吉

(淄博市第一醫(yī)院 1內(nèi)分泌科，山東 淄博 255200；2產(chǎn)科)

糖尿病腎病是糖尿病的常見(jiàn)并發(fā)癥之一，其發(fā)生機(jī)制尚未明確。研究顯示足細(xì)胞在糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用〔1〕。高糖(HG)是影響足細(xì)胞增殖和凋亡的重要因素，即可直接損傷足細(xì)胞，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，又可引起足細(xì)胞裂隙膜分子的完整性受損，發(fā)生蛋白尿〔2，3〕。從分子水平探討影響HG誘導(dǎo)的足細(xì)胞增殖和凋亡的機(jī)制，對(duì)于糖尿病腎病治療靶點(diǎn)的尋找有重要意義。微小RNA(miRNA)是一類小分子單鏈非編碼RNA，長(zhǎng)度為18～25個(gè)核苷酸，參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)行為，與糖尿病、心血管疾病、腫瘤等多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)〔4～6〕。底建敏等〔7〕研究顯示，miR-183可通過(guò)抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，影響子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后。王曉晶〔8〕研究顯示，miR-183在2型糖尿病中差異性表達(dá)，提示miR-183可能與糖尿病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。目前，還未有miR-183影響足細(xì)胞增殖和凋亡的相關(guān)報(bào)道。本研究通過(guò)HG誘導(dǎo)足細(xì)胞，探討miR-183對(duì)HG誘導(dǎo)的足細(xì)胞增殖和凋亡的影響及可能的作用機(jī)制，以期為糖尿病腎病的治療尋找新靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)試劑 小鼠足細(xì)胞(國(guó)家細(xì)胞庫(kù)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心-協(xié)和細(xì)胞庫(kù))；胎牛血清(FBS)和DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)和胰蛋白酶(美國(guó)Sigma公司)；LipofectamineTM2000試劑盒和Trizol試劑(美國(guó)Invitrogen公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑盒(日本TaKaRa公司)；PCR引物(上海生工生物工程有限公司)；鈣通道調(diào)節(jié)分子(Orai)1單克隆抗體(艾美捷科技有限公司)，酶切含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3多克隆抗體(美國(guó)Abnova公司)；磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)及磷酸化的哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)單克隆抗體(北京中杉金橋公司)；miR-183模擬物(mimics)及模擬陰性對(duì)照物、miR-183抑制劑及陰性對(duì)照和Orai1過(guò)表達(dá)載體(上海英駿生物技術(shù)有限公司)；二喹啉甲酸(BCA)蛋白測(cè)定試劑盒(上海碧云天公司)；雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Promega公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 各細(xì)胞均用含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔2 d更換1次新鮮的培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%左右時(shí)，吸棄培養(yǎng)基，加入適量的磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細(xì)胞，然后加入0.25%胰蛋白酶溶液消化，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分組 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的足細(xì)胞接種于6孔板中，每孔1×105個(gè)細(xì)胞。細(xì)胞融合度達(dá)到60%時(shí)，更換無(wú)FBS的培養(yǎng)基。參照LipofectamineTM2000試劑盒說(shuō)明書(shū)，分別轉(zhuǎn)染miR-183 mimics(miR-183組)及模擬陰性對(duì)照物(miR-NC組)、miR-183抑制劑(anti-miR-183組)及抑制劑陰性對(duì)照序列(anti-miR-NC組)、Orai1的過(guò)表達(dá)載體(pcDNA-Orai1組)及空載體(pcDNA組)、Orai1的小干擾RNA(si-Orai1組)及亂序無(wú)意義陰性序列(si-con組)、共轉(zhuǎn)染miR-183 mimics和Orai1過(guò)表達(dá)載體(miR-183+pcDNA-Orai1組)、miR-183 mimics和空載體(miR-183+si-con組)至足細(xì)胞。足細(xì)胞分為對(duì)照組(NG組)：常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)；HG6 h、HG12 h、HG24 h組：30 mmol/L的D-葡萄糖分別作用足細(xì)胞6 h、12 h、24 h。miR-183組、miR-con組、si-Orai1組、si-con組、miR-183+pcDNA-Orai1組和miR-183+si-con組細(xì)胞均使用30 mmol/L的D-葡萄糖作用24 h，并依次記為HG+miR-183組、HG+miR-con組、HG+si-Orai1組、HG+si-con組、HG+miR-183+pcDNA-Orai1組和HG+miR-183+si-con組。

1.2.3MTT檢測(cè)足細(xì)胞增殖 將足細(xì)胞或轉(zhuǎn)染后的各組足細(xì)胞接種于96孔板中，每孔1×103個(gè)細(xì)胞。按照上述分組處理后，每孔加入20 μl濃度為5 g/L的MTT溶液。培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸棄培養(yǎng)基，加入150 μl二甲基亞砜，輕輕振蕩混合均勻，于酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)定吸光度值(A)，并計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率(%)=A實(shí)驗(yàn)組/A對(duì)照組×100%。

1.2.4流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 細(xì)胞分組和處理同1.2.3，培養(yǎng)48 h后，胰酶消化并收集細(xì)胞。取1.0×106個(gè)細(xì)胞，適量PBS清洗2次。吸棄PBS，加入400 μl結(jié)合緩沖液，輕輕吹打使細(xì)胞混懸。加入10 μl Annexin V-FITC，室溫避光孵育15 min。再加入5 μl碘化丙啶(PI)，室溫避光孵育5 min。最后再加入100 μl結(jié)合緩沖液，混勻后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-183和Orai1 mRNA表達(dá)水平 Trizol試劑提取各組細(xì)胞中總RNA，微量核酸儀測(cè)量RNA的濃度和純度，A260 nm/A280 nm比值處于1.8～2.0范圍內(nèi)的RNA純度較高。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。再以cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR總反應(yīng)體系為20 μl，擴(kuò)增條件為95℃20 s，95℃5 s，60℃30 s，72℃30 s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。miR-183上游5′-CGTAGGGCCACTGGACGA-3′，下游5′-TTGTCCCCATTCCAGCCCTG-3′；Orai1上游5′-CTGCTGGGTCAAGTTCTTA-3′，下游5′-AGTGAACAGCAAAGACGATA-3′；U6上游5′-ACGCAAATTCGTGAAGCGTT-3′，下游5′-AACGCTTCACGAATT TGCGT-3′；GAPDH上游5′-CATCACCATCTTCCAGGAGCG-3′，下游5′-GAGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′。miR-183以U6為內(nèi)參，Orai1以GAPDH為內(nèi)參，2-△△Ct法計(jì)算miR-183和Orai1 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.6Western印跡檢測(cè)蛋白表達(dá) 加入含蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液，提取細(xì)胞中總蛋白。BCA蛋白試劑盒定量后，取適量蛋白，100℃煮沸5 min。蛋白變性后，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，每泳道30 μg蛋白。電泳結(jié)束后，濕轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，5%脫脂牛奶中封閉，時(shí)間為2 h。分別加入一抗，4℃孵育過(guò)夜。再加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗IgG，室溫孵育1 h。最后加入化學(xué)發(fā)光試劑ELC，避光顯影，凝膠成像系統(tǒng)曝光拍照。

1.2.7雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-183與Orai1靶向關(guān)系 生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)顯示：Orai1的3′UTR中含有與miR-183互補(bǔ)的核苷酸序列。PCR擴(kuò)增含有與miR-183互補(bǔ)的Orai1的3′UTR序列，構(gòu)建Orai1野生型質(zhì)粒(WT-Orai1)和突變型質(zhì)粒(MUT-Orai1)。分別共轉(zhuǎn)染Orai1-WT、Orai1-MUT與miR-183mimic、模擬陰性對(duì)照物至足細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞。使用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，取上清液，檢測(cè)各組的熒光素酶活性。具體操作過(guò)程參照雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1HG刺激對(duì)足細(xì)胞增殖、凋亡及miR-183和Orai1表達(dá)影響 與NG組比較，HG6 h、HG12 h、HG24 h組細(xì)胞存活率和miR-183水平顯著降低，而細(xì)胞凋亡率、酶切Caspase-3蛋白、Orai1 mRNA和蛋白水平顯著升高(均P<0.05)。由于HG24 h組細(xì)胞存活率接近50%，所以選擇HG作用時(shí)間為24 h作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)條件。見(jiàn)表1，圖1，圖2。

表1 HG處理足細(xì)胞miR-183和Orai1的表達(dá)

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)足細(xì)胞中Orai1蛋白表達(dá)

圖2 Western印跡檢測(cè)Orail、酶切Caspase-3蛋白表達(dá)

2.2上調(diào)miR-183表達(dá)對(duì)HG誘導(dǎo)的足細(xì)胞增殖和凋亡的影響 與HG+miR-con組比較，HG+miR-183組miR-183水平顯著升高(P<0.001)，表明miR-183 mimics轉(zhuǎn)染成功，足細(xì)胞中miR-183表達(dá)上調(diào)。與HG+miR-con組比較，HG+miR-183組細(xì)胞存活率顯著升高(P<0.001)，細(xì)胞凋亡率和酶切Caspase-3蛋白水平顯著降低(均P<0.001)。見(jiàn)圖3，表2。

圖3 足細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白酶切Caspase-3表達(dá)

表2 上調(diào)miR-183表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞增殖、凋亡的影響

2.3miR-183靶向調(diào)控Orai1表達(dá) 生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)顯示，Orai1的3′UTR的存在與miR-183互補(bǔ)的核苷酸序列。雙熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果顯示，與miR-con組比較，miR-183組轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-Orai1的熒光素酶活性顯著降低(P<0.001)，說(shuō)明miR-183可與Orai1的3′UTR靶向結(jié)合。見(jiàn)表3。Western印跡檢測(cè)顯示，miR-183組Orai1蛋白水平(0.23±0.04)顯著低于miR-con組(0.57±0.06，P<0.05)，anti-miR-183組Orai1蛋白水平(0.833±0.08)顯著高于anti-miR-con組(P<0.05)，說(shuō)明miR-183靶向負(fù)調(diào)控Orai1表達(dá)。見(jiàn)圖4，圖5。

表3 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

圖4 miR-183與Orai1互補(bǔ)的核苷酸序列

圖5 Western印跡檢測(cè)Orai1蛋白表達(dá)

2.4沉默Orai1對(duì)HG誘導(dǎo)的足細(xì)胞增殖和凋亡的影響 與HG+si-con組比較，HG+si-Orai1組Orai1蛋白水平顯著降低(P<0.001)，與HG+si-con組比較，HG+si-Orai1組細(xì)胞存活率顯著升高(P<0.001)，細(xì)胞凋亡率和酶切Caspase-3蛋白水平顯著降低(P<0.001)。見(jiàn)表4，圖6。

表4 沉默Orai1表達(dá)對(duì)HG誘導(dǎo)的足細(xì)胞增殖、凋亡的影響

圖6 足細(xì)胞中Orai1和酶切Caspase-3蛋白表達(dá)

2.5過(guò)表達(dá)Orai1部分逆轉(zhuǎn)上調(diào)miR-183表達(dá)對(duì)HG誘導(dǎo)的足細(xì)胞的增殖和凋亡的影響 與HG+miR-183+pcDNA組比較，HG+miR-183+pcDNA-Orai1組細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率和酶切Caspase-3蛋白水平顯著升高(均P<0.001)。見(jiàn)圖7、表5。

1，2:HG+miR-183+pcDNA組、HG+miR-183+pcDNA-Orai1組圖7 足細(xì)胞中Orai1和酶切Caspase-3蛋白表達(dá)

表5 過(guò)表達(dá)Orai1逆轉(zhuǎn)上調(diào)miR-183表達(dá)對(duì)足細(xì)胞增殖和凋亡的抑制作用

2.6過(guò)表達(dá)Orai1部分逆轉(zhuǎn)上調(diào)miR-183表達(dá)對(duì)HG誘導(dǎo)的足細(xì)胞Akt信號(hào)通路的影響 與NG組比較，HG組p-Akt和p-mTOR蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。與HG+miR-con組比較，HG+miR-183組p-Akt和p-mTOR蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。與HG+miR-183+pcDNA組比較，HG+miR-183+pcDNA-Orai1組p-Akt和p-mTOR蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)圖8，表6。

1～6:NC組、HG組、HG+miR-con組、HG+miR-183組、HG+miR-183+pcDNA組、HG+miR-183+pcNDA-Orai1組圖8 足細(xì)胞中p-AKT和p-mTOR蛋白表達(dá)

表6 過(guò)表達(dá)Orai1逆轉(zhuǎn)上調(diào)miR-183表達(dá)對(duì)HG誘導(dǎo)的足細(xì)胞p-AKT和p-mTOR蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

糖尿病腎病是糖尿病患者死亡的主要原因之一。足細(xì)胞是維持腎小球?yàn)V過(guò)膜正常通透性的主要成分，其功能受損可引起腎功能損傷，是糖尿病腎病發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵〔9〕。HG環(huán)境可導(dǎo)致足細(xì)胞數(shù)量減少，足細(xì)胞從基底膜脫落等，最終導(dǎo)致腎小球?yàn)V過(guò)屏障通透性增加，發(fā)生蛋白尿、腎小球硬化、腎功能喪失〔10〕。本研究結(jié)果顯示HG作用足細(xì)胞后，細(xì)胞增殖受到抑制，凋亡加劇，酶切Caspase-3蛋白表達(dá)水平升高，與相關(guān)研究報(bào)道結(jié)果一致〔11〕。阻止足細(xì)胞脫落、凋亡，維持其正常功能是防治及延緩糖尿病腎病發(fā)展進(jìn)程的關(guān)鍵因素之一。

miRNA參與糖尿病的發(fā)生與發(fā)展〔12〕。miR-183是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一種miRNA，參與調(diào)控細(xì)胞的增殖和凋亡。于健等〔13〕研究顯示，子宮內(nèi)膜癌組織中miR-183呈低表達(dá)，上調(diào)miR-183表達(dá)可能通過(guò)抑制Akt1的表達(dá)抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖。Wang等〔14〕研究顯示，miR-183在鼻咽癌組織和細(xì)胞中表達(dá)降低，上調(diào)miR-183表達(dá)明顯抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖和侵襲，并促進(jìn)順鉑誘導(dǎo)的鼻咽癌細(xì)胞凋亡。目前miR-183對(duì)足細(xì)胞增殖和凋亡的影響還未知。本研究結(jié)果提示miR-183可能參與糖尿病腎病的發(fā)生和發(fā)展；miR-183是糖尿病腎病治療的潛在靶點(diǎn)。

Orai1是定位于質(zhì)膜上的四次跨膜蛋白，也是鈣釋放激活鈣通道的主要成分。鈣釋放激活鈣通道與糖尿病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)〔15〕。Zbidi等〔16〕研究顯示，Orai1在2型糖尿病患者血小板中表達(dá)升高，與糖尿病的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。陳夢(mèng)楠等〔17〕研究顯示，HG在一定程度上抑制心肌細(xì)胞增殖，與HG誘導(dǎo)后心肌細(xì)胞中Orai1表達(dá)升高有關(guān)。目前，Orai1對(duì)HG誘導(dǎo)的足細(xì)胞增殖和凋亡的影響還未知。本研究結(jié)果提示Orai1可促進(jìn)糖尿病腎病的發(fā)生和發(fā)展。提示上調(diào)miR-183表達(dá)通過(guò)下調(diào)Orai1表達(dá)影響HG誘導(dǎo)的足細(xì)胞增殖和凋亡。

mTOR是雷帕霉素在哺乳動(dòng)物的靶分子，參與哺乳動(dòng)物細(xì)胞感受營(yíng)養(yǎng)信號(hào)、細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)信號(hào)的調(diào)控。Akt/mTOR信號(hào)通路參與糖尿病及糖尿病腎病的發(fā)生、發(fā)展。HG環(huán)境下，Akt/mTOR信號(hào)通路處于激活狀態(tài)〔18〕。腎小球足細(xì)胞mTOR活性的異常升高是糖尿病腎病發(fā)生蛋白尿的關(guān)鍵機(jī)制之一。本研究結(jié)果顯示，HG誘導(dǎo)后，足細(xì)胞中p-AKT和p-mTOR蛋白表達(dá)升高，與相關(guān)研究報(bào)道結(jié)果一致〔19〕，HG誘導(dǎo)激活了足細(xì)胞中Akt/mTOR信號(hào)通路。上調(diào)miR-183表達(dá)后，HG誘導(dǎo)的足細(xì)胞p-AKT和p-mTOR蛋白表達(dá)受到抑制，而過(guò)表達(dá)Orai1逆轉(zhuǎn)了上調(diào)miR-183表達(dá)對(duì)HG誘導(dǎo)的足細(xì)胞p-AKT和p-mTOR蛋白表達(dá)的抑制作用，提示上調(diào)miR-183表達(dá)可能通過(guò)下調(diào)Orai1表達(dá)，進(jìn)而抑制HG誘導(dǎo)的Akt/mTOR信號(hào)通路激活，保護(hù)足細(xì)胞免受損傷。

綜上，miR-183在HG誘導(dǎo)的足細(xì)胞中表達(dá)降低，上調(diào)miR-183表達(dá)可促進(jìn)HG誘導(dǎo)的足細(xì)胞增殖，抑制凋亡，這可能與miR-183靶向負(fù)調(diào)控Orai1表達(dá)及抑制Akt/mTOR信號(hào)通路的激活相關(guān)。