柑橘素對癲癇大鼠海馬組織氧化應(yīng)激因子及Caspase-9的作用

邵延萱 羅文哲 薛晴 李晶

(佳木斯大學(xué) 1 2018級臨床醫(yī)學(xué)5班，黑龍江 佳木斯 154007； 2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；3研究生院)

癲癇因為頭部神經(jīng)細(xì)胞同步化的高度放電(及細(xì)胞生物電異常)造成的一種發(fā)作性腦病。曾有學(xué)者指出〔1〕，氧自由基可參與癲癇的發(fā)作，其影響大腦正常功能的途徑可能是通過改變線粒體代謝實現(xiàn)的。而可以最直接地反映體內(nèi)氧化還原狀態(tài)，就是谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)，其濃度改變可直接反映機(jī)體的氧化還原狀態(tài)〔2〕。 半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-9在細(xì)胞凋亡與壞死中可通過介導(dǎo)及執(zhí)行死亡指令來發(fā)揮作用，癲癇發(fā)作同時伴有腦細(xì)胞的凋亡。作為黃酮類植物化合物的柑橘素，已有學(xué)者研究其可通過對抗炎癥和自由基生成、增加雌激素和一氧化氮(NO)數(shù)目來增強(qiáng)心功能發(fā)揮心臟保護(hù)效果〔3〕，對糖尿病患者也有顯著治療效果。還可降低血糖、預(yù)防血栓、抑制消化性潰瘍、氧化應(yīng)激、腫瘤、炎癥反應(yīng)、出血等生物學(xué)效應(yīng)〔4～10〕。本研究探討柑橘素對癲癇大鼠海馬組織氧化應(yīng)激標(biāo)志物 GSH-Px、SOD、MDA 濃度變化及Caspase-9的作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物 雄性成年SD大鼠30只，體重180～220 g〔哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院實驗動物中心，合格證號SCXK(黑) 2015-001〕，依隨機(jī)數(shù)字法分成空白組、癲癇組、柑橘素組各10只。研究經(jīng)佳木斯大學(xué)倫理委員會(JMSU-227)批準(zhǔn)合格，經(jīng)1 w的適應(yīng)性喂養(yǎng)后開始實驗。

1.2藥物、主要試劑和儀器 Sigma 公司購買的柑橘素和戊四氮(PTZ)；南京建成生物工程研究所購買的谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)試劑盒、氯化三苯基四氮唑(TTC)試劑；武漢博士德公司購買的兔抗 Caspase-9 多克隆抗體、鏈霉親和素-生物素復(fù)合物(SABC)試劑盒、磷酸鹽緩沖液(PBS)及枸櫞酸鈉緩沖液、多聚賴氨酸；成都泰盟科技有限公司的BI-2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)；日本三洋電器有限公司的醫(yī)用超低溫冰箱；上海安亭科學(xué)儀器廠生產(chǎn)的TGL-168高速臺式離心機(jī)；寧波新芝科學(xué)儀器研究所的電動玻璃勻漿機(jī)。

1.3動物分組及制造模型 將適應(yīng)性喂養(yǎng)后的大鼠隨機(jī)分為空白組(0.9%氯化鈉溶液灌胃+0.9%氯化鈉溶液腹腔注射)、癲癇組(0.9%氯化鈉溶液灌胃+PTZ腹腔注射)、柑橘素組(柑橘素溶液灌胃+PTZ腹腔注射)。給予劑量：50 mg/kg灌胃，35 mg/kg腹腔注射；連續(xù)28 d，每天固定時間段進(jìn)行操作，觀察并記錄大鼠是否有癲癇發(fā)作及發(fā)作表現(xiàn)。灌胃前禁食以增加吸收效果。造模成功標(biāo)準(zhǔn)按大鼠行為學(xué)表現(xiàn)判定(Ⅱ級或Ⅱ級以上發(fā)作持續(xù)5次)。

1.4行為學(xué)改變 依據(jù)Racine 6級指標(biāo)來判定：0級：無任何發(fā)作形式的表現(xiàn)；Ⅰ級：頭部抽動或點頭、咀嚼樣動作；Ⅱ級：有間斷性咀嚼動作，點頭現(xiàn)象也頻繁出現(xiàn)、有的上身會有像濕狗一樣的抖動；Ⅲ級：雙上肢或單側(cè)上肢有顫搐、陣攣；Ⅳ級：雙上肢抽搐并伴有直立動作；Ⅴ級：強(qiáng)直性陣攣與抽搐現(xiàn)象逐漸蔓延擴(kuò)展到全身，嚴(yán)重時大鼠不能正常站立，甚至直接跌倒在地。

1.5海馬組織中SOD、GSH-Px、MDA濃度 完成行為學(xué)監(jiān)測后進(jìn)行取材操作。按體重進(jìn)行麻醉操作(麻醉藥用戊巴比妥鈉)，待麻醉穩(wěn)定時斷頭處死，剪下鼠頭，在預(yù)先凍好的冰塊上迅速分離出大腦組織，并且嚴(yán)格按照大鼠大腦圖譜結(jié)構(gòu)中準(zhǔn)確定位仔細(xì)分離好所需的海馬組織，小心操作備用。漂洗血液用冰生理鹽水進(jìn)行，拿濾紙片把多余的鹽水吸干凈，配成 10%的海馬組織勻漿液(海馬與鹽水比例為1∶9)，經(jīng)離心后(10 min，3 000 r/min)取上清液備有。檢測海馬組織中3種因子的濃度嚴(yán)格按試劑盒說明書操作所有步驟。

1.6海馬組織中Caspase-9陽性細(xì)胞數(shù) 海馬組織免疫組化染色觀察并計算陽性細(xì)胞數(shù)。分離出的海馬用甲醛固定后石蠟包埋，加入Caspase-9一抗，待4℃過夜后加二抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記的工作液，經(jīng)二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色后復(fù)染(蘇木素)，檢測海馬中的陽性細(xì)胞。光鏡下看到胞核棕黃色即陽性細(xì)胞。視野下選擇不重復(fù)的視覺區(qū)域范圍，計算符合條件的胞核或胞質(zhì)呈黃染的陽性細(xì)胞數(shù)目總數(shù)，取平均值。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.13組行為學(xué)改變 癲癇組一般會出現(xiàn)肌陣攣及縮頭動作；而有的大鼠也有其他一系列全身或局部的狀態(tài)表現(xiàn)：如口唇發(fā)紺、呼吸受抑、眼球充血、前后肢痙攣抽搐或全身強(qiáng)直陣攣發(fā)作。這些發(fā)作表現(xiàn)通常會發(fā)生在給予PTZ腹腔注射的3 min以后，大多數(shù)大鼠一般在給藥后的7 min內(nèi)基本可以表現(xiàn)出典型的行為學(xué)改變，即達(dá)到發(fā)作高潮階段；多數(shù)大鼠癥狀會在20 min之內(nèi)逐漸減輕至最終恢復(fù)安靜狀態(tài)。空白組沒有行為改變。相對癲癇組，柑橘素組躁動或抽搐的程度明顯緩解或減輕，發(fā)作的潛伏期也延長了。

2.23組海馬組織中SOD、GSH-Px、MDA濃度變化 癲癇組海馬組織中SOD、GSH-Px濃度較空白組顯著降低，而MDA濃度顯著增加(均P<0.05)；柑橘素組海馬組織中SOD、GSH-Px含量較癲癇組顯著升高，而MDA濃度顯著下降(P<0.05)，見表1。

表1 3組海馬組織中SOD、GSH-Px、MDA濃度的變化

2.33組海馬組織中Caspase-9陽性細(xì)胞數(shù)變化 癲癇組Caspase-9陽性細(xì)胞數(shù)〔(31.98±2.47)個/視野〕顯著多于對照組〔(15.37±0.45)個/視野〕；而柑橘素組Caspase-9陽性細(xì)胞數(shù)〔(19.86±0.54)個/視野〕顯著低于癲癇組(P<0.05)。

2.4海馬組織Caspase-9免疫組化染色結(jié)果 鏡下可見空白組細(xì)胞整齊排列、呈正常形態(tài)、胞核染色也很淺，有較大的胞體；癲癇組陽性細(xì)胞數(shù)大幅增加，胞核染色深且不規(guī)則、有時會有胞核碎裂和聚集；柑橘素組較癲癇組陽性細(xì)胞數(shù)降低尤為明顯。見圖1。

空白組

3 討 論

氧化應(yīng)激是參與癲癇發(fā)病造成腦損傷的重要內(nèi)在機(jī)制〔11,12〕，而細(xì)胞凋亡又是影響疾病進(jìn)程的主要途徑。癲癇時抗氧化系統(tǒng)和增多的氧自由基之間平衡失調(diào)，加快細(xì)胞凋亡進(jìn)程。所以說腦神經(jīng)細(xì)胞的有效保護(hù)方式可從對抗氧化應(yīng)激入手。其中，抗氧化劑SOD可最直接反映機(jī)體抗氧化水平，它對細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用可因降低過氧化脂質(zhì)產(chǎn)生，除掉一些超氧陰離子發(fā)揮作用。脂質(zhì)自由基降解后的產(chǎn)物是具有毒性的MDA〔13〕，機(jī)體細(xì)胞損傷的嚴(yán)重程度可靠其濃度變化間接反映出來〔14〕。GSH-Px〔15〕能降低脂質(zhì)過氧化作用對機(jī)體的損傷，還具備降解膽固醇過氧化物等生物學(xué)作用〔16〕。本研究說明柑橘素可抵抗脂質(zhì)過氧化作用，雙向調(diào)節(jié)抗氧化酶活性(上調(diào)SOD、GSH-Px；下調(diào)MDA)而起到腦細(xì)胞保護(hù)效果。其可能是由于SOD可把體內(nèi)超氧陰離子除掉后使過氧化脂質(zhì)減少生成，進(jìn)而發(fā)揮了細(xì)胞膜的保護(hù)，減弱了這些自由基對大腦的損害〔17〕。

細(xì)胞凋亡通路的重要啟動因子為Caspase-9，這其中又包含3個相互聯(lián)系的通路：死亡受體(以Caspase-8啟動)〔18〕、線粒體(以Caspase-9啟動)〔19〕、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(以Caspase-12啟動)〔20〕。本研究提示PTZ建立的癲癇模型誘發(fā)了Caspase-9被激活，而Caspase-9又和癲癇造成的凋亡現(xiàn)象有關(guān)。而柑橘素可通過介導(dǎo)細(xì)胞凋亡途徑來達(dá)到保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的效果。作為黃酮類植物化合物的柑橘素，有很大潛力和生物學(xué)作用，可改善心受損肌和動脈硬化、降低癌癥細(xì)胞增殖與炎性因子濃度、消除自由基等。綜上，柑橘素可能通過消除自由基生成、強(qiáng)化抗氧化酶活性、削弱細(xì)胞凋亡等方式對癲癇大鼠神經(jīng)細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)效果。