金線蓮黃酮調控RKIP抑制喉鱗癌細胞增殖、遷移和侵襲的機制

王慧敏 李靜波 王俊杰 陳文明 蔡紀堂

(河南省中醫院耳鼻喉科，河南 鄭州 450000)

喉癌屬于頭頸部惡性腫瘤，隨著環境污染及生活節奏的加快導致喉癌發病率逐年增加，其主要病理類型為喉鱗狀細胞癌，目前臨床主要采用手術、放療及化療等方式治療喉癌，雖有一定治療效果，但仍有大部分患者仍發生復發及轉移而降低治療效果〔1,2〕。由于喉癌患者早期癥狀較為隱匿，導致早期診斷準確率較低，大部分患者就診時已處于進展期，導致患者預后差，已有研究表明飲食不健康、吸煙等均可能誘發喉癌〔3〕。中醫藥抗癌已成為研究熱點，研究表明部分中醫藥可有效治療喉癌，但關于其具體作用機制尚未完全闡明〔4〕。因而基于喉癌發病機制積極尋找治療喉癌的新型中藥對提高治療效果及臨床合理用藥均有重要意義。研究發現金線蓮對宮頸癌、結腸癌、喉癌的生長增殖有一定的抑制作用〔5〕。但金線蓮黃酮對喉癌增殖等生物行為的影響及其機制目前還未有研究。Raf1激酶抑制蛋白(RKIP)在下咽癌下調表達，RKIP低表達可促進下咽癌發生轉移〔6〕。相關研究報道指出RKIP可能通過下調血管內皮生長因子(VEGF)表達進而抑制喉鱗癌發生及轉移〔7〕。但有關金線蓮黃酮是否通過調控RKIP表達而殺傷喉鱗癌細胞的內在機制尚未見報道。因此，本研究旨在探討金線蓮黃酮對喉鱗癌細胞增殖、遷移及侵襲的影響，初步分析其是否可通過調控RKIP表達而發揮作用。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 喉癌Hep-2細胞購自美國ATCC細胞庫。金線蓮購自福建漳州且經屬性鑒定為蘭科開唇蘭屬植物福建金線蓮，精密稱取1 g金線蓮，全株剪碎，磨成汁液，水浴提取，過濾，按照參考文獻進行操作〔8〕，測定吸光度，計算金線蓮中總黃酮含量。DMEM培養基、胎牛血清與胰蛋白酶均購自美國Gibco公司；LipofectamineTM2000轉染試劑盒購自美國Invitrogen公司；siRNA-RKIP及其陰性對照均購自上海吉瑪制藥技術有限公司；四甲基偶氮唑藍(MTT)檢測試劑盒購自美國Amresco公司；Transwell小室與Matrigel基質膠均購自北京樂博生物科技有限公司；Trizol試劑、反轉錄試劑盒與實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)試劑盒均購自大連寶生物工程有限公司；蛋白裂解液與BCA蛋白定量試劑盒均購自上海碧云天生物技術有限公司；兔抗人RKIP多克隆抗體、兔抗人p21、CyclinD1抗體與辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔IgG二抗均購自美國CST公司；兔抗人E-cadherin抗體購自美國BD公司；兔抗人基質金屬蛋白酶(MMP)-2抗體購自美國Santa Cruz公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養、藥物處理及分組 喉癌Hep-2細胞常規復蘇后置于含有10%胎牛血清及青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM培養基進行培養，收集對數生長期細胞用0.25%胰蛋白酶消化細胞，調整細胞密度為5×104個/ml，放入37℃、5%CO2培養箱內繼續培養24 h，隨機分為對照組、金線蓮黃酮(0.04、0.08、0.16、0.32、0.64 mg/ml)組〔9〕，每組均設置6個復孔。為驗證RKIP過表達對喉癌細胞增殖、遷移及侵襲的影響，分別將RKIP過表達載體及空載體分別轉染入喉癌Hep-2細胞，分別為pcDNA3.1-RKIP組、pcDNA3.1組。另將siRNA-RKIP及其陰性對照分別轉染入喉癌Hep-2細胞12 h，加入濃度為0.16 mg/ml的金線蓮黃酮處理48 h，分別為金線蓮黃酮0.16 mg/ml+si-RKIP組、金線蓮0.16 mg/ml+si-NC組，目的是驗證金線蓮黃酮是否通過調控RKIP表達進而影響喉癌細胞增殖、遷移及侵襲過程，轉染步驟均嚴格按照LipofectamineTM2000轉染試劑盒說明書進行操作。

1.2.2MTT檢測細胞增殖 收集對數生長期喉癌Hep-2細胞，胰蛋白酶消化細胞，調整細胞密度為5×104個/ml，收集細胞后以每孔5×104個細胞的密度接種于96孔板，每組均設置3個復孔，分別于轉染或處理后的24 h、48 h、72 h時，加入20 μl MTT溶液，放入恒溫培養箱繼續培養4 h，棄培養基，加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，低速振蕩混勻20 min，利用酶標儀檢測波長為490 nm處各孔吸光度(OD)值。

1.2.3Transwell實驗檢測細胞遷移 用不含血清的DMEM培養基200 μl稀釋各組喉癌Hep-2細胞，細胞密度為1×105/ml，取200 μl細胞稀釋液放入Transwell小室上室，取含10%胎牛血清的DMEM培養基600 μl加入Transwell小室下室，置于37℃、5%CO2體積分數、相對濕度95%的培養箱內繼續培養24 h，取出Transwell小室，棉簽擦拭Transwell小室聚碳酸酯膜表面細胞，多聚甲醛固定10 min，0.1%結晶紫染液染色15 min，置于顯微鏡下觀察并隨機選取5個視野計算遷移細胞個數。

1.2.4Transwell實驗檢測細胞侵襲 取各組對數生長期喉癌Hep-2細胞，用0.25%胰蛋白酶消化細胞，加入無血清的DMEM培養基制備細胞懸液(2×105/ml)，預備實驗：使用無血清DMEM培養基稀釋基質膠，取100 μl稀釋液包被Transwell小室底部的上室面，Transwell小室上室內加入200 μl細胞懸浮液，Transwell小室下室內加入600 μl含10%胎牛血清的DMEM培養基，放入恒溫培養箱內繼續培養24 h，取出Transwell小室，棉簽擦拭Transwell小室上室表面細胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次×5 min，多聚甲醛固定10 min，0.1%結晶紫染液染色15 min，置于顯微鏡下觀察并隨機選取5個視野計算侵襲細胞個數。

1.2.5qRT-PCR檢測細胞中RKIP mRNA表達水平 收集各組喉癌Hep-2細胞，采用Trizol法提取細胞總RNA，紫外分光光度計檢測RNA濃度，選取A260/A280≥1.8的RNA樣本進行后續實驗，參照反轉錄試劑盒說明書合成模板鏈cDNA，采用qRT-PCR法檢測RKIP mRNA相對表達量，qRT-PCR條件為95℃ 2 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，循環40次。每個樣品均設置3個復孔，采用2-ΔΔCt法計算RKIP mRNA相對表達量。

1.2.6Western印跡檢測RKIP、E-cadherin、P21、CyclinD1、MMP-2蛋白表達 收集各組喉癌Hep-2細胞，加入蛋白裂解液冰上裂解30 min，12 000 r/min離心10 min提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，取30 μg蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，將分離的蛋白凝膠轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，室溫條件下5%脫脂奶粉封閉1 h，分別加入各蛋白一抗，TBST洗滌，分別加入二抗，室溫孵育1 h，TBST洗滌，ECL顯影，利用凝膠分析系統及Image J軟件分析各條帶灰度值。

1.3統計學方法 采用SPSS21.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1金線蓮黃酮對細胞Hep-2增殖的影響 與對照組相比，金線蓮黃酮0.04 mg/ml組、金線蓮黃酮0.08 mg/ml組、金線蓮黃酮0.16 mg/ml組、金線蓮黃酮0.32 mg/ml組、金線蓮黃酮0.64 mg/ml組喉癌Hep-2細胞增殖活性均顯著降低，CyclinD1蛋白水平顯著降低，而p21蛋白水平顯著升高且呈劑量依賴性(均P<0.05)，見表1、圖1。表明金線蓮黃酮可明顯抑制喉癌Hep-2細胞增殖。選用48 h時喉癌Hep-2細胞增殖活性約為50%的金線蓮黃酮濃度(0.16 mg/ml)做后續使用。

表1 金線蓮黃酮對細胞Hep-2增殖的影響

1～6:對照組；金錢蓮黃酮0.04 mg/ml組;金錢蓮黃酮0.08 mg/ml組;金錢蓮黃酮0.16 mg/ml組;金錢蓮黃酮0.32 mg/ml組;金錢蓮黃酮0.64 mg/ml組圖1 金線蓮黃酮對細胞Hep-2增殖蛋白表達的影響

2.2金線蓮黃酮對細胞Hep-2遷移、侵襲的影響 與對照組相比，金線蓮黃酮0.16 mg/ml組喉癌Hep-2細胞遷移及侵襲細胞數目均顯著減少(P<0.001)，金線蓮黃酮0.16 mg/ml組喉癌Hep-2細胞中E-cadherin表達水平顯著高于對照組(P<0.001)，而MMP-2表達水平顯著低于對照組(P<0.001)，見圖2、表2、圖3。表明金線蓮黃酮可明顯抑制喉癌Hep-2細胞遷移及侵襲。

圖2 金線蓮黃酮對細胞Hep-2遷移、侵襲的影響(結晶紫染色，×200)

圖3 金線蓮黃酮對細胞Hep-2遷移、侵襲蛋白表達的影響

2.3金線蓮黃酮對細胞Hep-2中RKIP表達的影響 與對照組相比，金線蓮黃酮0.16 mg/ml組喉癌Hep-2細胞中RKIP mRNA及蛋白水平均顯著升高(P<0.001)，見圖4、表2。

表2 金線蓮黃酮對細胞Hep-2遷移、侵襲、PKIP表達的影響

圖4 金線蓮黃酮對細胞Hep-2中RKIP蛋白表達的影響

2.4過表達RKIP對細胞Hep-2增殖、遷移、侵襲的影響 與pcDNA3.1組相比，pcDNA3.1-RKIP組喉癌Hep-2細胞中RKIP蛋白水平顯著升高(P<0.001)，提示轉染效果良好。同pcDNA3.1組相比，pcDNA3.1-RKIP組喉癌Hep-2細胞活性顯著降低(P<0.001)，遷移及侵襲細胞數目均顯著減少(P<0.001)，E-cadherin、p21蛋白水平均顯著升高(P<0.001)，而CyclinD1、MMP-2蛋白水平均顯著降低(P<0.001)，見表3、圖5。

表3 過表達RKIP對細胞Hep-2增殖、遷移、侵襲的影響

圖5 過表達RKIP對細胞Hep-2增殖、遷移、侵襲蛋白表達的影響

2.5抑制RKIP表達能逆轉金線蓮黃酮對細胞Hep-2增殖的作用 與金線蓮黃酮0.16 mg/ml+si-NC組相比，金線蓮黃酮0.16 mg/ml+si-RKIP組喉癌Hep-2細胞活性顯著升高(P<0.001)，CyclinD1蛋白水平顯著升高(P<0.001)，而p21蛋白水平顯著降低(P<0.001)，見圖6、表4。

1、2：金線蓮黃酮0.16 mg/ml+si-NC組;金線蓮黃酮0.16 mg/ml+si-RKIP組；圖7同圖6 抑制RKIP表達能逆轉金線蓮黃酮對細胞Hep-2增殖蛋白表達的影響

表4 抑制RKIP表達能逆轉金線蓮黃酮對細胞Hep-2增殖、遷移及侵襲的抑制作用

2.6抑制RKIP表達能逆轉金線蓮黃酮對細胞Hep-2遷移、侵襲的作用 與金線蓮黃酮0.16 mg/ml+si-NC組相比，金線蓮黃酮0.16 mg/ml+si-RKIP組喉癌Hep-2細胞遷移及侵襲細胞數目均顯著增加(P<0.001)，MMP-2蛋白水平顯著升高(P<0.001)，而E-cadherin、PKIP蛋白水平顯著降低(P<0.001)，見表4、圖7。

圖7 抑制RKIP表達能逆轉金線蓮黃酮對細胞Hep-2遷移、侵襲蛋白的影響

3 討 論

頭頸部惡性腫瘤中喉癌的發病率相對較高，目前臨床治療手段常可損傷正常組織干細胞增殖活性而引發胃腸道不良反應，嚴重降低患者生活質量甚至影響治療效果〔10～12〕。現代醫學對中醫藥治療癌癥的研究進展取得較大突破，因此探究中醫藥治療喉癌的作用機制對抗腫瘤新藥研發及應用提供理論依據。

金線蓮有滋陰降火、消炎止痛及清涼解毒等功效，對高血壓、腎炎、類風濕關節炎等均有較好治療效果〔13〕。研究報道指出金線蓮中多種活性成分可用于治療多種惡性腫瘤，但關于其具體作用機制尚未完全闡明〔14〕。金線蓮的多糖成分可通過干擾肺癌、結腸癌等多種惡性腫瘤細胞周期而抑制腫瘤細胞增殖進而發揮抗腫瘤作用〔15〕。金線蓮的揮發油成分可通過引發線粒體凋亡途徑進而促進肺癌細胞凋亡〔16〕。已有研究報道指出細胞周期改變、細胞凋亡減少及遷移能力增強均可促進腫瘤惡性進展，CyclinD1可正向調控細胞周期進程進而促進細胞增殖，而p21可通過抑制CyclinD1與相關蛋白結合進而抑制細胞增殖，上皮-間質轉化(EMT)是促進腫瘤細胞遷移及侵襲的主要因素之一，E-cadherin表達上調預示EMT過程發生逆轉，可抑制細胞轉移，細胞侵襲相關蛋白MMP-2可明顯促進腫瘤細胞侵襲〔17,18〕。說明金線蓮黃酮可通過抑制喉鱗癌細胞增殖、遷移及侵襲進而影響腫瘤惡性進展。提示金線蓮黃酮可能通過誘導EMT進程進而抑制喉鱗癌細胞遷移及侵襲。

RKIP屬于磷脂酰乙醇胺結合蛋白家族成員，其可通過調控轉錄因子-核因子(NF)-κB及絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)等信號通路進而影響細胞增殖及分化過程，研究表明RKIP屬于抑癌基因且在腫瘤組織及細胞系中均呈低表達，RKIP低表達可影響腫瘤細胞穩定性進而增加細胞遷移及侵襲〔19〕。研究表明RKIP表達水平降低與鼻咽癌細胞遷移及侵襲密切相關，其可能通過激活NF-κB信號通路進而促進鼻咽癌細胞遷移及侵襲〔20〕。RKIP過表達可明顯抑制前列腺癌等多種惡性腫瘤細胞轉移〔21〕。本研究結果提示金線蓮黃酮可能通過上調RKIP表達而減弱喉癌細胞增殖、遷移及侵襲能力；金線蓮黃酮可通過上調RKIP表達進而降低喉癌細胞增殖、遷移及侵襲能力。

綜上，金線蓮黃酮有抑制喉鱗癌細胞增殖、遷移及侵襲的作用，其作用機制可能是通過上調RKIP表達而影響相關基因及蛋白表達而實現的，可為臨床應用金線蓮黃酮治療喉鱗癌提供理論依據及實驗基礎。但關于金線蓮黃酮對RKIP基因上游調控基因及其相關信號通路的調控作用仍需深入研究。