區(qū)域性耐碳青霉烯類(lèi)抗生素肺炎克雷伯菌耐藥基因型的分析*

佟忠山，尤玉紅，姜月紅，杜 英，杜 巍，孫 磊

黑龍江省醫(yī)院檢驗(yàn)科，黑龍江 哈爾濱 150001

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，KPN）是臨床感染性疾病常見(jiàn)的病原菌，可引起社區(qū)獲得性感染和醫(yī)院感染，約占臨床革蘭陰性細(xì)菌感染的30%，可引起呼吸道、血液、腹腔和泌尿系統(tǒng)等部位感染，特別是免疫力低下的人群更易感染［1］。碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物是抗菌譜最廣，抗菌活性最強(qiáng)的非典型β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素，已成為治療嚴(yán)重細(xì)菌感染的最主要抗菌藥物之一，隨著碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物在臨床的廣泛應(yīng)用，全國(guó)耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)統(tǒng)計(jì)顯示耐碳青霉烯類(lèi)抗生素肺炎克雷伯菌（carbapenem resistant Klebsiella pneumoniae，CR-KPN）檢出率持續(xù)上升，從2013年的4.9%上升至2019年的10.9%［2］，為臨床抗感染的治療增加很多困難和經(jīng)濟(jì)成本，區(qū)域CR-KPN耐藥性及耐藥基因的研究，為本地區(qū)CR-KPN院感防控及臨床相關(guān)感染治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種來(lái)源

黑龍江省醫(yī)院是哈爾濱地區(qū)三甲醫(yī)院，收集醫(yī)院2018年1月—2020年12月臨床分離的KPN 3 371株，去除同一患者同一部位相同菌株，以首次分離菌為準(zhǔn)。篩選亞胺培南、美羅培南和厄他培南任一非敏感菌株為CR-KPN的36株納入本研究。

1.2 儀器與試劑

BD PhoenixTM-100全自動(dòng)細(xì)菌鑒定、藥敏系統(tǒng)及其配套試劑（美國(guó)碧迪公司）。美羅培南藥敏紙片（英國(guó)Oxoid公司），替加環(huán)素藥敏紙片（美國(guó)輝瑞公司），血平板、麥康凱平板和MHA平板（鄭州博賽公司）。碳青霉烯酶檢測(cè)試劑盒購(gòu)于長(zhǎng)沙中生眾捷生物技術(shù)有限公司。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株

大腸埃希菌ATCC25922和肺炎克雷伯菌ATCC700603，購(gòu)自國(guó)家衛(wèi)生健康委臨床檢驗(yàn)中心。

1.4 菌株鑒定及藥敏試驗(yàn)

菌株分純配制0.5麥?zhǔn)蠞岫染鷳乙海?jīng)BD PhoenixTM-100全自動(dòng)細(xì)菌鑒定/藥敏系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)菌鑒定及藥敏試驗(yàn)，并用Kirby-Bauer法補(bǔ)充替加環(huán)素和頭孢哌酮/舒巴坦藥敏試驗(yàn)，結(jié)果按美國(guó)臨床微生物實(shí)驗(yàn)室CLSI M100第30版標(biāo)準(zhǔn)判讀。

1.5 碳青霉烯酶表型篩查

篩查參考美國(guó)臨床微生物實(shí)驗(yàn)室CLSI M100第30版改良碳青霉烯滅活試驗(yàn)方法，取血平板上過(guò)夜孵育的1 ul滿(mǎn)環(huán)KPN接種至2 ml TSB中，漩渦震蕩10～15 s，用無(wú)菌鑷子將一張10μg美羅培南紙片加入每一菌液管中，確保紙片完全浸沒(méi)于菌懸液中。在35±2℃空氣環(huán)境孵育4 h±15 min，完成TSB-美羅培南紙片菌懸液孵育后，立即用生理鹽水或營(yíng)養(yǎng)肉湯制備大腸埃希菌ATCC25922 0.5麥?zhǔn)蠞岫葮?biāo)準(zhǔn)菌懸液，按紙片擴(kuò)散法常規(guī)步驟將大腸埃希菌ATCC25922涂布于MHA培養(yǎng)基上，平板干燥3～10 min后，使用10μl接種環(huán)從TSB-美羅培南紙片菌懸液中取出，貼在事先涂有大腸埃希菌ATCC25922的MHA瓊脂表面。在空氣環(huán)境35±2℃孵育18～24 h后，測(cè)量抑菌圈直徑6～15 mm之間或16～18 mm抑菌圈內(nèi)存在針尖樣菌落為碳青霉烯酶陽(yáng)性。

1.6 耐藥基因檢測(cè)

取提取緩沖液5滴加入EP管中，使用1 ul接種環(huán)取一環(huán)碳青霉烯酶表型篩查陽(yáng)性待測(cè)菌株置于含有提取緩沖液的EP管中，合上EP管，使用渦旋儀震蕩混勻后放置室溫10 min，然后用吸管吸取5滴制備好的混合液，加入膠體金免疫層析檢測(cè)卡中，室溫放置15 min讀取結(jié)果。C線(xiàn)區(qū)出現(xiàn)一條紅線(xiàn)并且在K、O、V、I、N檢測(cè)線(xiàn)區(qū)出現(xiàn)一條或多條紅線(xiàn)判讀為陽(yáng)性結(jié)果，同時(shí)對(duì)blaKPC、blaOXA-48、blaVIM、blaIMP和blaNDM五種常見(jiàn)碳青霉烯酶基因型進(jìn)行檢測(cè)［3］。

2 結(jié)果

2.1 CR-KPN臨床分布情況

2018年1月—2020年12月醫(yī)院分離出3 371株KPN，其中36株CR-KPN（1.07%），主要分離自神經(jīng)外科（25%），ICU、康復(fù)科、呼吸科和心血管內(nèi)科（各13.9%）；CR-KPN感染患者年齡主要集中在80歲以上老年群體（36.1%），并且以男性患者為主（83.3%），多分離自呼吸道標(biāo)本（66.1%），見(jiàn)表1。

表1 36株CR-KPN的臨床分布情況

2.2 藥敏結(jié)果

36株CR-KPN對(duì)臨床常見(jiàn)抗菌藥物藥敏結(jié)果如表2所示，對(duì)氨芐西林/舒巴坦、哌拉西林、頭孢噻肟、頭孢唑啉、亞胺培南的耐藥率為100%，對(duì)氨曲南、頭孢吡肟、阿莫西林/克拉維酸、環(huán)丙沙星、四環(huán)素、頭孢他啶、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢哌酮/舒巴坦、美羅培南的耐藥率接近100%，但阿米卡星（5.56%）、替加環(huán)素（35.49%）和慶大霉素（44.44%）的耐藥率低于45%，氯霉素和左氧氟沙星也有20%以上的敏感度，見(jiàn)表2。

表2 36株CR-KPN對(duì)臨床常見(jiàn)抗菌藥物耐藥性統(tǒng)計(jì)表

2.3 碳青霉烯酶表型試驗(yàn)及基因檢測(cè)結(jié)果

36株CR-KPN改良碳青霉烯滅活試驗(yàn)陽(yáng)性率100%，耐藥基因檢出情況如表3所示。醫(yī)院分離的CR-KPN主要攜帶blaKPC基因型，檢出blaKPC35株（97.22%），檢出blaNDM，聯(lián)產(chǎn)blaKPC+blaVIM和blaKPC++blaIMP各1株（2.78%），未檢出blaOXA-48，見(jiàn)表3。

表3 36株耐碳青霉烯類(lèi)肺炎克雷伯菌（CRKP）耐藥基因檢出情況

3 討論

全國(guó)CR-KPN檢出率從2014年的6.4%上升至2019年10.9%。通過(guò)醫(yī)院研究結(jié)果表明本地區(qū)明顯低于全國(guó)CR-KPN檢出率，但近兩年呈逐年上升趨勢(shì)，需引起臨床高度重視。CR-KPN主要來(lái)源于神經(jīng)外科、ICU和康復(fù)、呼吸等科，患者合并兩種以上慢性病，住院時(shí)間超過(guò)三周，留置插管兩種以上，應(yīng)用碳青霉烯類(lèi)藥物一周以上易檢出CR-KPN感染［4］，存在上述危險(xiǎn)因素患者需加強(qiáng)病原菌監(jiān)測(cè)，盡早檢出并及時(shí)治療。

本研究結(jié)果顯示，醫(yī)院檢出的CR-KPN對(duì)一二三四代頭孢菌素及克拉維酸和舒巴坦等常用酶抑制劑β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素都耐藥，對(duì)阿米卡星和慶大霉素氨基糖苷類(lèi)、四環(huán)素類(lèi)等抗生素有一定敏感度，可能與氨基糖苷類(lèi)抗生素主要通過(guò)與細(xì)菌核糖體結(jié)合，干擾細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成，發(fā)揮殺菌作用，與碳青霉烯類(lèi)抗生素作用機(jī)制不同有關(guān)，上述情況與李珂等的研究結(jié)果一致［5］。CR-KPN耐藥廣，而且氨基糖苷類(lèi)和四環(huán)素類(lèi)抗生素副作用大，限制了臨床使用，新藥頭孢他啶/阿維巴坦對(duì)blaKPC基因型CR-KPN有很好抑制作用，對(duì)blaNDM基因型CR-KPN無(wú)作用，而攜帶blaNDM金屬酶的CR-KPN對(duì)氨曲南水解作用弱，氨曲南對(duì)其有一定抑制作用，所以可以參考耐藥基因型合理選擇抗菌藥物治療。

綜上所述，哈爾濱地區(qū)CR-KPN臨床檢出逐年增加，其耐藥性強(qiáng)，難清除，臨床抗感染難道大，需加強(qiáng)病原菌監(jiān)測(cè)，并進(jìn)行耐藥基因檢測(cè)，CR-KPN耐藥機(jī)制復(fù)雜，需進(jìn)一步研究更好指導(dǎo)臨床合理使用抗菌藥物，做好院感防控避免院內(nèi)感染的爆發(fā)流行。